ke dalam alkohol absolut absolut I, II, III selama 20 menit sampai 1 jam tergantung besar-kecilnya ukuran jaringan. Sampel dijemihkan dengan
merendam di dalam silol I, II dan III masing-masing selama 20 menit hingga 1 jam tergantung besar-kecilnya ukuran jaringan. Pada xilol III
sampel dihangatkan pada suhu parafin cair. Sampel diinfiltrasi dengan parafin parafin I, II, III pada suhu 65-70
°
C dalam inkubator masing- masing selama 1 jam.
3.9.2 Pembuatan Blok Embedding
Sampel yang telah diinfiltrasi dapat dicetak dengan parafin melalui proses embedding. Proses embedding diawali dengan menyiapkan cetakan
yang ukurannya sesuai dengan sampel jaringan. Jaringan dimasukkan pada cetakan dengan posisi bagian yang akan dipotong. Pada satu cetakan dapat
diisi beberapa jaringan. Cetakan dapat didinginkan pada cold plate untuk mempercepat pembekuan. Setelah seluruh parafin membeku, blok parafin
dapat dikeluarkan dari dalam cetakan. Blok parafin dapat langsung di-triming untuk mempermudah pemotongan dengan menggunakan microtom rotary.
3.9.3 Prosedur Triming
Triming adalah penipisan sampel untuk mendapat jaringan atau bagian organ yang benar dan bagus dalam orientasi dan memfasilitasi larutan
fiksasi masuk sampai pada bagian terdalam. Prosedur triming diawali dengan mengeluarkan organ terpilih dari dalam fiksator atau larutan penyimpan.
Organ dipotong pada bagian yang diinginkan dengan dua mata pisau. Ukuran ketebalan sampel + 3-
5 μm dengan luas permukaan + 1x1 cm
2
. Selanjutnya, sampel dapat diproses lebih lanjut, seperti pewarnaan HE
Hematoksilin Eosin dan IHK Imuno Histo Kimia.
3.10 Pengamatan Histolopatologi Organ Hati, Ginjal, dan Kolon melalui Pewarnaan Hemaksilin-Eosin HE
Pewarnaan Hemaksilin-Eosin HE dilakukan mengikuti prosedur Kiernan 1990. Pemrosesan jaringan menjadi preparat histopatologi melalui tahapan-
tahapan sebagai berikut; fiksasi jaringan, dehidrasi, clearing, infiltrasi,
embedding, trimming, sectioning, deparafinisasi dan dilanjutkan dengan staining pewarnaan. Fiksasi jaringan dilakukan dengan merendam sampel jaringan ke
dalam larutan formaldehid. Sampel jaringan yang sudah menjadi histopat direndam ke dalam xylol I selama 5-10 menit untuk menghilangkan parafin,
kemudian direndam dalam xylol II kembali untuk membilas selama 5-10 menit. Setelah itu, sampel direndam dalam alkohol.
Pada tahap ini sampel berturut-turut direndam dalam alkohol yang menurun konsentrasinya secara bertingkat, yaitu: alkohol absolut 100, alkohol 96,
kemudian alkohol 70 masing-masing 5 menit. Konsentrasi yang menurun secara berturut-turut tersebut akan membuat air memasuki sampel jaringan. Sampel
kemudian direndam dalam akuades selama 5 menit dan direndam dalam larutan hematoksilin selama 5-10 menit. Hematoksilin akan mewarnai inti sel pada
sampel jaringan dengan warna biru. Setelah itu, sampel dimasukkan dalam air mengalir secara tidak langsung selama 5-10 menit untuk membilas. Tahap
pewarnaan selanjutnya adalah pewarnaan dengan pewarna eosin selama 1-2 menit untuk mewarnai sitosol sel pada sampel jaringan.
Setelah tahap ini, sampel memasuki tahap pencelupan alkohol yang meningkat konsentrasinya secara berturut-turut sebagai kebalikan dari tahap yang
sebelumnya, yaitu: alkohol 70, alkohol 96 dan alkohol absolut 100 masing-masing sebanyak 3-4 celupan. Pada akhir tahap pewarnaan, sampel
kembali direndam dengan xylol selama 5-10 menit, kemudian direndam kembali dalam xylol selama 5-10 menit. Setelah itu, sampel jaringan ditutup dengan gelas
penutup dan direkatkan dengan entellan. Slide histopatologi siap diamati di bawah mikroskop dan difoto secara
digital. Perubahan histopatologi yang terlihat pada jaringan dikelompokkan berdasarkan organ yang akan diamati. Pada jaringan hati diamati adanya infiltrasi
radang, kariopiknosis, dan degenerasi lemak. Pada jaringan ginjal diamati adanya hemoragi, kariopiknosis, nekrosis, dan infiltrasi radang. Pada jaringan kolon
diamati tingkatan kolitis peradangan. Tingkatan kolitis dianalisis mengikuti protokol Cooper 1993, Suzuki et al. 2006. Skor 0 apabila mukosa kolon normal
dan tidak terjadi infiltrasi radang. Skor 1 apabila kripta memendek 13 kripta dengan sedikit infitrasi sel radang dan edema. Skor 2 apabila 23 kripta hilang dan
terjadi infiltrasi radang. Skor 3 ditandai oleh hilangnya kripta dengan infiltrasi radang yang parah pada lamina propria tetapi masih tersisanya epitel permukaan.
Skor 4 ditandai hilangnya semua kripta dan terjadi infitrasi radang yang parah pada mukosa, submukosa, dan muskularis mukosa.
3.11 Analisis Keberadaan Penanda Permukaan Sel Th CD4 dan Kaspase-3 dengan Pewarnaan Imunohistokimia IHK
Analisis keberadaan penanda permukaan sel Th CD4 dan Kaspase-3 dengan pewarnaan imunohistokimia IHK dilakukan mengikuti prosedur Kiernan
1990, yang meliputi preparasi gelas objek, pelapisan gelas objek dengan agen penempel, penempelan preparat ke gelas objek, serta pewarnaan imunohistokimia.
3.11.1 Preparasi Gelas Objek
Preparasi gelas objek diawali dengan menyiapkan gelas objek yang akan digunakan untuk penempelan afixing preparat. Gelas objek
dimasukkan ke dalam staining jar yang berisi alkohol 70 sampai semua bagian terendam, kecuali bagian yang kasar tempat pelabelan. Staining jar
yang berisi gelas objek tersebut kemudian dimasukkan ke dalam bak electromagnetic cleaner yang telah diisi air sejajar dengan alkohol yang
terdapat dalam staining jar. Electromagnetic cleaner dihidupkan selama 20 menit untuk membersihkan gelas objek dari lemak atau segala kotoran yang
menempel yang dapat mengganggu dalam proses imunohistokimia. Gelas objek dimasukkan ke dalam staining jar dan direndam dengan
menggunakan milique air yang sudah disuling berulang-ulang sebanyak 3 kali, masing-masing 20 menit, dilanjutkan perendaman staining jar yang
berisi gelas objek ke dalam electromagnetic cleaner selama 20 menit.
3.11.2 Pelapisan Coating Gelas Objek dengan Gelatin Agen Penempel
Pelapisan coating dilakukan dengan melarutkan 2.50-3.00 g gelatin dalam 300-400 ml air panas bersuhu maksimal 60 °C, kemudian
didinginkan hingga mencapai suhu ruang. Selanjutnya, kromium potasium sulfat CrKSO
4 2
sebanyak 0,25 g dimasukkan dan diaduk. Setelah itu,
