terjadi infiltrasi radang. Skor 3 ditandai oleh hilangnya kripta dengan infiltrasi radang yang parah pada lamina propria tetapi masih tersisanya epitel permukaan.
Skor 4 ditandai hilangnya semua kripta dan terjadi infitrasi radang yang parah pada mukosa, submukosa, dan muskularis mukosa.
3.11 Analisis Keberadaan Penanda Permukaan Sel Th CD4 dan Kaspase-3 dengan Pewarnaan Imunohistokimia IHK
Analisis keberadaan penanda permukaan sel Th CD4 dan Kaspase-3 dengan pewarnaan imunohistokimia IHK dilakukan mengikuti prosedur Kiernan
1990, yang meliputi preparasi gelas objek, pelapisan gelas objek dengan agen penempel, penempelan preparat ke gelas objek, serta pewarnaan imunohistokimia.
3.11.1 Preparasi Gelas Objek
Preparasi gelas objek diawali dengan menyiapkan gelas objek yang akan digunakan untuk penempelan afixing preparat. Gelas objek
dimasukkan ke dalam staining jar yang berisi alkohol 70 sampai semua bagian terendam, kecuali bagian yang kasar tempat pelabelan. Staining jar
yang berisi gelas objek tersebut kemudian dimasukkan ke dalam bak electromagnetic cleaner yang telah diisi air sejajar dengan alkohol yang
terdapat dalam staining jar. Electromagnetic cleaner dihidupkan selama 20 menit untuk membersihkan gelas objek dari lemak atau segala kotoran yang
menempel yang dapat mengganggu dalam proses imunohistokimia. Gelas objek dimasukkan ke dalam staining jar dan direndam dengan
menggunakan milique air yang sudah disuling berulang-ulang sebanyak 3 kali, masing-masing 20 menit, dilanjutkan perendaman staining jar yang
berisi gelas objek ke dalam electromagnetic cleaner selama 20 menit.
3.11.2 Pelapisan Coating Gelas Objek dengan Gelatin Agen Penempel
Pelapisan coating dilakukan dengan melarutkan 2.50-3.00 g gelatin dalam 300-400 ml air panas bersuhu maksimal 60 °C, kemudian
didinginkan hingga mencapai suhu ruang. Selanjutnya, kromium potasium sulfat CrKSO
4 2
sebanyak 0,25 g dimasukkan dan diaduk. Setelah itu,
ditambahkan H
2
O hingga volumenya mencapai 500 ml. Gelas objek yang bersih direndam dalam larutan tersebut selama 15-30 menit, kemudian
dikeringkan pada suhu ruang. Setelah kering, gelas objek disimpan di dalam oven dengan suhu + 60°C untuk menghindari penempelan segala macam
kotoran pada gelas objek.
3.11.3 Pembuatan Irisan Preparat pada Gelas Objek Sectioning
Tahapan pembuatan irisan preparat meliputi beberapa tahap secara berurutan, yaitu penempatan blok embedding pada holder microtom
rotary, pemasangan pisau pemotong, penentuan ketebalan sayatan, triming dan penempelan afixing. Preparat diiris dengan microtom rotary pada
ketebalan sayatan 3- 5 μm.
3.11.4 Penempelan Irisan Preparat pada Gelas Objek Afixing
Proses penempelan atau afiksasi dengan menggunakan air bersuhu 40
°
C atau dengan dimasukkan ke dalam inkubator bersuhu 39-40
°
C selama 24 jam. Sebelum dimasukkan ke dalam air hangat atau bersuhu 40
°
C dengan menggunakan gelas objek atau gelas benda, sampel sayatan jaringan
dimasukkan ke dalam air bersuhu dingin terlebih dahulu. Hal ini bertujuan meregangkan jaringan tidak mengkerut dan lebih mempermudah proses
penempelan.
3.11.5 Persiapan Preparat untuk Pewarnaan Imunohistokimia IHK a. Deparaffinisasi Rehidrasi
Langkah ini diawali proses deparafinasi rehidrasi dengan merendam jaringan pada gelas objek dalam larutan xylol sebanyak tiga kali, masing-
masing selama 10 menit. Selanjutnya, dilanjutkan dengan merendam jaringan dalam larutan etanol pro-analysis dengan konsentrasi bertingkat,
mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah. Konsentrasi etanol yang digunakan adalah 100, 96, 80 dan 70. Perendaman dalam masing-masing konsentrasi
etanol dilakukan sebanyak dua kali. Masing-masing perendaman tersebut dilakukan selama 10 menit. Proses deparafinisasi diakhiri dengan
perendaman jaringan dalam akuades sebanyak dua kali, masing-masing perendaman dilakukan selama 5 menit.
b. Antigen Unmasking
Antigen unmasking bertujuan untuk membuka epitop antigen, sehingga antigen dapat berikatan dengan antibodi. Antigen unmasking
dilakukan dengan merebus jaringan dalam 10 mM larutan PBST buffer natrium sitrat pada suhu sub-boiling 85°C selama 10 menit. Buffer
natrium sitrat dibuat dengan melarutkan 2,94 g C
6
H
5
Na
3
O
7
•2H
2
O dalam 1 L akuades. Pada tahap ini, suhu perebusan harus dijaga agar tidak melebihi
atau kurang dari 85°C. Perebusan dilakukan di dalam wadah stainless-steel yang diletakkan di atas hot-plate. Buffer natrium sitrat harus dijaga agar
tidak mendidih selama proses perebusan. Selanjutnya, langkah yang dilakukan adalah proses pendinginan cooling jaringan. Proses pendinginan
dilakukan dengan tetap merendam jaringan di dalam wadah tanpa ditutup pada suhu ruang. Pada proses ini, suhu awal dan akhir perebusan serta suhu
awal dan akhir pendinginan harus dicatat. Hal ini akan memudahkan dalam optimasi suhu proses antigen unmasking selanjutnya.
c. Pewarnaan Staining
Proses pewarnaan staining dilakukan setelah proses pendinginan pada antigen unmasking. Pewarnaan diawali dengan merendam jaringan
pada gelas objek dengan akuades. Proses ini dilakukan sebanyak tiga kali, masing-masing 5 menit. Dalam hal ini, proses perendaman yang pertama
dilakukan dengan merendam seluruh gelas objek dalam wadah yang berisi akuades. Proses ini segera dilakukan setelah proses pendinginan berakhir.
Hal seperti ini akan memudahkan proses selanjutnya dan jaringan tidak mudah kering. Sebelum berlanjut pada perendaman berikutnya, jaringan
pada gelas objek diberi batas dengan PAP-pen Peroksidasi Anti Peroksidase - pen yang mengandung 1-bromopropan. Jaringan yang
dibatasi oleh PAP-pen akan memudahkan proses perendaman selanjutnya. Hal ini agar larutan perendam tidak meluap ke batas luar jaringan tersebut.
Selanjutnya, perendaman dengan akuades yang kedua dan ketiga dilakukan dengan memindahkan gelas objek ke dalam wadah berbentuk
kotak yang di bagian dasarnya terdapat tisu yang dibasahi dengan akuades. Pada bagian atas tisu tersebut diberi dua penyangga untuk meletakkan gelas
objek agar tidak langsung menyentuh tisu yang basah tersebut. Dalam kondisi tersebut, proses perendaman jaringan dilakukan dengan meneteskan
akuades melalui pipet tetes tepat di atas jaringan. Perendaman jaringan dilanjutkan di dalam larutan 3 H
2
O
2
dengan cara diteteskan. Perendaman ini dilakukan selama 10 menit. Setelah itu,
perendaman dilakukan di dalam akuades lagi dengan cara diteteskan tepat di atas jaringan. Perendaman ini dilakukan sebanyak dua kali, masing-masing
selama 5 menit. Perendaman dilanjutkan di dalam larutan PBS phosphate buffer saline selama 5 menit. Dalam hal ini, PBS berperan sebagai larutan
pencuci wash buffer. PBS dibuat dengan cara melarutkan tablet PBS ke dalam akuades, dengan perbandingan satu tablet PBS dilarutkan dalam 200
ml akuades. Pada saat pembuatan PBS, ditambahkan Tween 20 sebanyak satu tetes. Tween 20 berperan sebagai deterjen, yaitu untuk menyatukan
antara PBS dengan protein target. Tween 20 juga dapat membersihkan protein-protein lain yang bukan target, sehingga memperjelas pengamatan
protein target. Perendaman dilanjutkan di dalam larutan blocking blocking solution
selama satu jam. Larutan blocking dibuat dengan cara melarutkan susu skim skim milk ke dalam PBS, dengan perbandingan 0,1 g susu skim dilarutkan
dalam 100 ml PBS. Perendaman dengan larutan blocking dilakukan dengan cara diteteskan tepat di atas jaringan. Volume larutan blocking yang dapat
diteteskan adalah 100- 400 μL pada suhu ruang. Penetesan larutan blocking
dilakukan dengan mikropipet. Perendaman selanjutnya adalah perendaman jaringan dalam larutan
antibodi primer dengan proses inkubasi pada suhu 4°C suhu kulkas selama semalam overnight. Perendaman dengan antibodi primer dilakukan dengan
cara diteteskan tepat di atas jaringan, sebelum diinkubasi dengan suhu 4°C. Volume larutan antibodi primer yang diteteskan adalah 100-40
0 μL dengan
