3. METODE Polymerase Chain Reaction PCR
3.1. Ekstraksi DNA E. coli, Bifidobacteria dan Enterococcus faecium dari
feses.
Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan QIAmp Stool Mini Kit Qiagen, Jerman, dengan langkah sebagai berikut :
Sampel feses sebanyak 0,5 gram dimasukkan ke dalam tabung 15 ml steril dan ditambahkan buffer ASL sebanyak 5 ml, kemudian divorteks selama 1
menit sampai sampel feses homogen. Lysate diambil sebanyak 2 ml dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian dilakukan pemanasan dalam
waterbath pada suhu 80
o
C selama 5 menit. Selanjutnya larutan tersebut divorteks selama 15 detik dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm
selama 1 menit. Supernatan diambil sebanyak 1,2 ml dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian ditambahkan 1 tablet InhibitEX dan divorteks
sampai tablet tersebut terlarut, selanjutnya diinkubasikan pada suhu kamar selama 1 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3
menit. Semua supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf , selanjutnya disentrifugasi kembali dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3
menit. Proteinase K sebanyak 15 µl dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang baru, kemudian supernatan tersebut diatas diambil 200 µl dan dimasukkan
ke dalam tabung eppendorf yang mengandung proteinase K. Setelah itu ditambahkan buffer AL sebanyak 200 µl dan divorteks selama 15 detik,
diinkubasikan selama 10 menit pada suhu 70
o
C dalam waterbath. Selanjutnya lysate ditambah dengan 200 µl etanol 96 dan divorteks untuk mencapur
larutan tersebut. Larutan tersebut diambil 500 µl dan dimasukkan ke dalam QIAmp spin column yang dilengkapi dengan tabung koleksi, kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit dan tabung koleksi yang mengandung filtrat dibuang. QIAmp spin column tersebut diambil kembali
dan dipasang lagi dengan tabung koleksi yang baru. Selanjutnya buffer AW1 sebanyak 500 µl dimasukkan ke dalam column tersebut dan disentrifugasi
dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit dan tabung koleksi yang mengandung filtrat dibuang. QIAmp spin column tersebut diambil kembali dan
dipasang lagi dengan tabung koleksi yang baru. Selanjutnya buffer AW2 sebanyak 500 µl dimasukkan ke dalam column tersebut dan disentrifugasi
dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit dan tabung koleksi yang
mengandung filtrat dibuang. QIAmp spin column tersebut diambil kembali dan dipasang lagi dengan tabung eppendorf. Kemudian buffer AE sebanyak 200 µl
dimasukkan ke dalam column tersebut, diinkubasikan selama 1 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit dan tabung
eppendorf yang mengandung filtrat diambil, kemudian disimpan pada suhu - 20
o
3.1.1. Amplifikasi DNA E. coli menggunakan primers universal stress protein A uspA
C.
Prosedur amplifikasi PCR fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan primers uspA, forward : 5’- CCG ATA CGC TGC CAA TCA GT -3’ dan reverse :
5’- ACG CAG ACC GTA AGG GCC AGA T -3 Chen Griffiths,1998, dimodifikasi. PCR dilakukan dengan total volume 50 µl larutan reaksi yang
terdiri dari 30.65 µl nuclease free water Applichem, 5 µl 10 X PCR buffer Vivantis, 4 µl MgCl
2
Vivantis, 25 mM, 1 µl dNTP Vivantis, 10 mM, 2 µl primers Midland, 10 pmolµl, 0,35 µl Taq Polymerase Vivantis, 5 Uµl dan 5
µl DNA templat. Kontrol positif dan negatif harus diikutkan dalam setiap amplifikasi. PCR dilakukan menggunakan mesin ABI 9700 dengan siklus sebagai
berikut, 1 siklus pada suhu 94
o
C selama 5 menit, 35 siklus pada suhu 94
o
C selama 1 menit, 60
o
C selama 1 menit dan pada suhu 72
o
C selama 1 menit, dan dilanjutkan dengan 1 siklus pada suhu 72
o
Produk PCR amplikon diambil 10 µl dan dicampur dengan 2 µl loading dye Vivantis, selanjutnya diseparasi menggunakan 2 agarose Promega
yang telah ditambahkan ethidium bromide Applichem 0,5 µgml pada tegangan 120 V selama 50 menit dengan menggunakan marker 100 bp DNA ladder
Vivantis. Hasil elektroforesis selanjutnya dilihat dengan menggunakan Gel Documentation System Vilber Lourmat.
C selama 5 menit.
3.1.2. Amplifikasi DNA Bifidobacteria primers g-Bifid Prosedur amplifikasi PCR fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan
primers g-Bifid, forward : 5’- CTC CTG GAA ACG GGT GG-3’dan reverse : 5’- GGT GTT CTT CCC GAT ATC TAC A -3’ Matsuki et al, 2002, dimodifikasi.
PCR dilakukan dengan total volume 50 µl larutan reaksi yang terdiri dari 30.65 µl nuclease free water Applichem, 5 µl 10 X PCR buffer Vivantis, 4 µl
MgCl
2
Vivantis, 25 mM, 1 µl dNTP Vivantis, 10 mM, 2 µl primers Midland, 10 pmolµl, 0,35 µl Taq Polymerase Vivantis, 5 Uµl dan 5 µl DNA templat.
Kontrol positif dan negatif harus diikutkan dalam setiap amplifikasi. PCR
Kategori