substrat tetramethylbenzidine TMB dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37
2.3. Larutan pereaksi dan antibodi untuk ELISA
C sehingga terbentuk warna biru dan kerapatan optik langsung diukur pada panjang gelombang 615 nm dengan menggunakan ELISA reader. Kurva standar
IgA dibuat dari nilai rata-rata OD standar IgA pada setiap konsentrasi. Rata-rata OD yang diperoleh dari setiap sampel diplotkan terhadap kurva standar sehingga
didapat nilal konsentrasi IgA sampel µgµl, kemudian dikonversi dengan faktor pengenceran dan diubah satuannya ke dalam µgg bb feses.
a. Larutan stock PBS 10X Phosphat Buffer Saline, pH 7,4 Sebanyak 137,8 g disodium hydogen orthophosphate Na
2
HPO
4
, BM 358,15 dan 15,9 sodium dihydrogen orthophosphate monohydrate
NaH
2
PO
4
.H
2
b. Larutan PBS 1X 0, BM 137,90 dan 90 g sodium chloride NaCl ditambahkan
sedikit demi sedikit ke dalam 500 ml aquabides dan ditepatkan volumenya hingga 1 liter.
Sebanyak 50 ml larutan stock PBS 10X ditambahkan aquabides sebanyak 450 ml dan disimpan pada suhu 4
c. Larutan pencuci PBS-Tween 20 0,05 C.
Sebanyak 0,5 ml tween 20 dilarutkan dengan 1 liter PBS 1X. d. Larutan buffer karbonat-bikarbonat
Satu kapsul karbonat-bikarbonat Sigma dilarutkan dalam 100 ml aquabidest, kemudian dihomogenkan.
e. Larutan blocking PBS-skim 5 Sebanyak 5 g susu skim dilarutkan dengan larutan PBS 1X hingga
volume 100 ml. f. Substrat TMB
Satu tablet 3,3’, 5,5’-tetramethyl-benzidine dilarutkan dalam 9 ml phosphate citrate-buffer dan 1 µl larutan hydrogen peroksidase 30 .
Kemudian ditambahkan dimehyl sulfoksida kemurnian 99,9 sebanyak 1ml.
3. METODE Polymerase Chain Reaction PCR
3.1. Ekstraksi DNA E. coli, Bifidobacteria dan Enterococcus faecium dari
feses.
Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan QIAmp Stool Mini Kit Qiagen, Jerman, dengan langkah sebagai berikut :
Sampel feses sebanyak 0,5 gram dimasukkan ke dalam tabung 15 ml steril dan ditambahkan buffer ASL sebanyak 5 ml, kemudian divorteks selama 1
menit sampai sampel feses homogen. Lysate diambil sebanyak 2 ml dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian dilakukan pemanasan dalam
waterbath pada suhu 80
o
C selama 5 menit. Selanjutnya larutan tersebut divorteks selama 15 detik dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm
selama 1 menit. Supernatan diambil sebanyak 1,2 ml dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian ditambahkan 1 tablet InhibitEX dan divorteks
sampai tablet tersebut terlarut, selanjutnya diinkubasikan pada suhu kamar selama 1 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3
menit. Semua supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf , selanjutnya disentrifugasi kembali dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3
menit. Proteinase K sebanyak 15 µl dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang baru, kemudian supernatan tersebut diatas diambil 200 µl dan dimasukkan
ke dalam tabung eppendorf yang mengandung proteinase K. Setelah itu ditambahkan buffer AL sebanyak 200 µl dan divorteks selama 15 detik,
diinkubasikan selama 10 menit pada suhu 70
o
C dalam waterbath. Selanjutnya lysate ditambah dengan 200 µl etanol 96 dan divorteks untuk mencapur
larutan tersebut. Larutan tersebut diambil 500 µl dan dimasukkan ke dalam QIAmp spin column yang dilengkapi dengan tabung koleksi, kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit dan tabung koleksi yang mengandung filtrat dibuang. QIAmp spin column tersebut diambil kembali
dan dipasang lagi dengan tabung koleksi yang baru. Selanjutnya buffer AW1 sebanyak 500 µl dimasukkan ke dalam column tersebut dan disentrifugasi
dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit dan tabung koleksi yang mengandung filtrat dibuang. QIAmp spin column tersebut diambil kembali dan
dipasang lagi dengan tabung koleksi yang baru. Selanjutnya buffer AW2 sebanyak 500 µl dimasukkan ke dalam column tersebut dan disentrifugasi
dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit dan tabung koleksi yang
Kategori