22
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitan
Penelitian yang dilakukan merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan desain faktorial.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Penelitian
1. Variabel Penelitian
a. Variabel bebas. Level tinggi dan level rendah dari lama pencampuran dan kecepatan putar.
b. Variabel tergantung. 1 Uji iritasi primer: eritema dan edema
2 Uji aktivitas antimikroba: diameter zona hambat 3 Uji sifat fisik: viskositas dan daya sebar
4 Uji stabilitas fisik: pergeseran viskositas setelah penyimpanan
selama satu bulan c. Variabel pengacau terkendali.
1 Uji iritasi: kelinci yang digunakan yaitu kelinci albino, kondisi
kandang, lama aplikasi.
2 Uji aktivitas
antimikroba: kepadatan
suspensi bakteri
Staphylococcus epidermidis setara dengan larutan standar Mac
Farland 0.5, diameter lubang sumuran, suhu inkubasi, dan lama
inkubasi.
3 Uji sifat fisik: jenis dan ukuran mixer, suhu pencampuran, kondisi
penyimpanan. 4 Uji stabilitas fisik: kondisi wadah dan penyimpanan.
d. Variabel pengacau tak terkendali.
1 Uji iritasi: makanan kelinci, kondisi fisiologis kelinci, laju
evaporasi minyak cengkeh.
2 Uji aktivitas antimikroba: suhu ruangan saat pengujian, laju
evaporasi minyak cengkeh. 3 Uji sifat fisik: suhu ruangan saat proses pembuatan emulgel.
4 Uji stabilitas fisik: suhu ruangan saat penyimpanan.
2. Definisi Operasional
a. Minyak cengkeh
adalah minyak esensial dari daun tanaman cengkeh Eugenia caryophyllata Thunb. yang diperoleh dari CV Indaroma
Yogyakarta sertifikat analisis terlampir. b.
Emulgel adalah sediaan semisolid hasil emulsifikasi minyak daun cengkeh
dengan emulsifying agent Tween 80 dan Span 80 dan penambahan Carbopol 940 sebagai gelling agent yang dibuat sesuai prosedur dalam
penelitian ini. c.
Lama pencampuran adalah waktu yang diperlukan mixer untuk proses
emulsifikasi dan pencampuran emulsi dengan gelling agent.
d. Kecepatan putar
adalah banyaknya putaran mixer per menit dalam proses
emulsifikasi dan penambahan gelling agent. e.
Desain faktorial adalah metode untuk mengetahui faktor yang dominan
dalam menentukan sifat fisik dan stabilitas fisik emulgel minyak cengkeh. f.
Faktor adalah besaran yang mempengaruhi respon, dalam penelitian ini
yaitu lama dan kecepatan putar pada prosese pencampuran emulgel. g.
Level adalah tingkatan jumlah atau besarnya faktor, dalam penelitian ini
terdapat dua level yaitu level rendah dan level tinggi. Level rendah lama pencampuran adalah 10 menit dan level tinggi adalah 30 menit. Level
rendah kecepatan putar adalah 200 rpm dan level tinggi adalah 500 rpm. h.
Respon adalah hasil percobaan yang akan diamati perubahannya secara
kuantitatif. i.
Pengaruh adalah perubahan respon yang disebabkan variasi level dan
faktor. j.
Iritasi primer adalah terjadinya eritema dan edema pada kulit kelinci
yang diolesi emulgel minyak cengkeh. Eritema merupakan terjadinya kemerahan dan edema merupakan terjadinya pembengkakan yang
disebabkan oleh akumulasi cairan dalam jaringan tubuh. k.
Aktivitas antimikroba adalah daya hambat emulgel minyak cengkeh
terhadap Staphylococcus epidermidis yang ditunjukkan dengan diameter
zona hambat dalam media Mueller Hinton Agar MHA. l.
Sifat fisik emulgel adalah parameter yang digunakan untuk mengetahui
kualitas fisik emulgel yang meliputi viskositas dan daya sebar.
m. Stabilitas fisik emulgel
adalah parameter yang digunakan untuk mengetahui ada tidaknya perubahan emulgel dalam penyimpanan yaitu
perubahan viskositas selama penyimpanan 1 bulan. n.
Daya sebar adalah diameter penyebaran 1 gram emulgel yang didiamkan
48 jam setelah pembuatan pada alat uji daya sebar yang diberi beban kaca
seberat 55 gram yang didiamkan selama 1 menit. o.
Viskositas adalah hambatan emulgel yang didiamkan 48 jam setelah
pembuatan untuk mengalir setelah adanya pemberian gaya. p.
Pergeseran viskositas adalah persentase dari selisih viskositas emulgel
dalam penyimpanan selama 1 bulan dengan viskositas emulgel setelah
dibuat.
C. Bahan Penelitian
Minyak cengkeh Oleum caryophylli yang diperoleh dari CV Indaroma Yogyakarta, Carbopol 940 kualitas farmasetis, gliserin kualitas
farmasetis, Tween 80 dan Span 80 sebagai emulsifying agent, parafin cair, trietanolamin, dan aquadest, media Mueller Hinton Agar Merck dan Mueller
Hinton Broth Merck, dan bakteri uji Staphylococcus epidermidis yang diperoleh dari Dinas Kesehatan D.I. Yogyakarta, Balai Laboratorium Kesehatan
Yogyakarta.
D. Alat Penelitian
Alat-alat gelas bekker glass, kaca pengaduk, erlenmeyer, neraca digital, waterbath, mixer merk Philip modifikasi Elecsa, USD, pipet ukur, cawan petri,
tabung reaksi, viscotester seri VT 04 RION-JAPAN, stopwatch, alat pengukur daya sebar, mistar, vortex, jarum ose, alat pembuat sumuran, autoklaf, dan inkubator.
E. Tata Cara Penelitian
1. Identifikasi Minyak Cengkeh
Minyak cengkeh Oleum caryophylli yang diperoleh dari CV Indaroma Yogyakarta dan telah diuji identitasnya, dibuktikan dengan Certificate
of Analysis.
2. Verifikasi Minyak Cengkeh
a. Verifikasi indeks bias minyak cengkeh. Indeks bias minyak cengkeh diukur menggunakan refractometer Abbe. Minyak cengkeh diteteskan pada prisma
utama, kemudian prisma ditutup dan refraktometer diarahkan ke cahaya terang, sehingga melalui lensa skala sehingga dapat dilihat dengan jelas dan
ditentukan nilai indeks biasnya. Refraktometer dialiri air mengalir dan diatur suhunya menjadi 20
o
C. Nilai indeks bias minyak cengkeh ditunjukkan oleh skala yang pada saat terdapat garis batas yang memisahkan sisi terang dan sisi
gelap pada bagian atas dan bawah. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. b. Verifikasi bobot jenis minyak cengkeh. Bobot jenis minyak cengkeh diukur
dengan menggunakan piknometer yang telah dikalibrasi, dengan menetapkan bobot piknometer kosong dan bobot air pada suhu 25
O
C. Piknometer diisi minyak cengkeh dan suhu dikondisikan pada 25
O
C, kemudian piknometer
ditimbang. Bobot piknometer yang telah diisi minyak cengkeh kemudian dikurangi bobot piknometer kosong. Bobot jenis minyak cengkeh merupakan
perbandingan antara bobot jenis minyak cengkeh dengan bobot air, pada suhu 25
O
C. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
3. Formulasi Emulgel dengan Kombinasi Lama pencampuran dan
Kecepatan Putar mixer
Formula yang digunakan adalah : R Minyak cengkeh
15 g
Carbopol 940 2
g Trietanolamin
0,6 g Paraffin liquidum
1 g
Tween 80 17,5 g
Span 80 2,5 g
Gliserin 2,0 g
Metil paraben 0,18 g
Propil paraben 0,02 g
Aquadest 56,3 g
Cara pembuatan emulgel: Carbopol 940 dikembangkan dengan menggunakan
sebagian aquadest dari formula selama 24 jam, kemudian semua bahan yang termasuk dalam fase minyak minyak cengkeh, parafin cair, dan
span 80 dicampur terlebih dahulu pada suhu 50
o
C. Semua bahan yang termasuk fase air juga dicampur terlebih dahulu pada suhu 50
o
C. Campuran fase minyak dicampurkan ke dalam fase air dengan mixer.
Selanjutnya ke dalam emulsi ditambahkan Carbopol 940 yang sebelumnya telah dikembangkan dengan aquadest dan dicampur
dengan mixer. Proses pencampuran emulsifikasi dan penambahan
Carbopol dilakukan sesuai dengan level faktor yang telah ditentukan lama pencampuran : 10 menit dan 30 menit; kecepatan putar 200 rpm
dan 500 rpm. Triethanolamin ditambahkan ke dalam campuran, kemudian campuran diaduk kembali dengan mixer selama 5 menit dan
terbentuk emulgel.
Tabel II. Level rendah dan level tinggi lama dan kecepatan putar pada proses pembuatan emulgel minyak cengkeh
Formula Lama Pencampuran
Kecepatan Putar
1 10 menit
200 rpm a
30 menit 200 rpm
b 10 menit
500 rpm ab
30 menit 500 rpm
Keterangan :
F 1 = lama pencampuran level rendah, kecepatan putar level rendah F a = lama pencampuran level tinggi, kecepatan putar level rendah
F b = lama pencampuran level rendah, kecepatan putar level tinggi F ab = lama pencampuran level tinggi, kecepatan putar level tinggi
4. Uji pH
Uji pH dilakukan dengan cara mengukur pH sediaan emulgel minyak cengkeh setelah dibuat menggunakan indikator kertas pH. Nilai pH
yang diinginkan adalah berada dalam rentang pH yang tidak mengiritasi kulit, yaitu 5-6.
5. Uji Iritasi Primer Emulgel
Bulu bagian punggung kelinci dicukur kemudian dibagi menjadi 2 sisi kiri dan kanan untuk sediaan emulgel dan basis emulgel sebagai kontrol
dengan area berukuran kira-kira 1 inchi x 1 inchi 2,54 cm x 2,54 cm di masing-masing sisi. Setiap formula yang akan diuji dan basis ditimbang 0,5
gram, kemudian diaplikasikan ke kulit kelinci. Bagian kulit kelinci ditutup dan
dibungkus dengan kain kasa. Kelinci tersebut dikembalikan ke kandang. Hasil uji diamati pada 24, 48, dan 72 jam setelah perlakuan. Sediaan emulgel dan
basis dihilangkan, sisi perlakuan dibersihkan dengan air untuk menghilangkan residu Deveda, et al., 2010.
6. Uji Sifat Fisik Emulgel
a. Uji viskositas. Pengukuran viskositas menggunakan alat Viscotester Rion- Japan seri VT-04 dengan cara : sediaan emulgel dimasukkan dalam wadah
dan dipasang pada portable viscotester. Viskositas emulgel diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas. Viskositas yang
dikehendaki dalam penelitian ini antara 200 – 300 d.Pa.s. Pengujian viskositas dilakukan 48 jam setelah emulgel dibuat. Dilakukan replikasi
sebanyak 3 kali. b. Uji daya sebar. Sediaan emulgel ditimbang seberat 1 gram dan diletakkan
di tengah kaca bulat berskala. Di atas emulgel diletakkan kaca bulat lain seberat 55 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat
penyebarannya. Daya sebar yang dikehendaki di dalam penelitian ini yaitu 3 – 5 cm. Pengujian daya sebar dilakukan 48 jam setelah emulgel selesai
dibuat. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
7. Uji Stabilitas Fisik Emulgel
Uji stabilitas fisik dilihat dengan melihat presentase pergeseran viskositas setelah penyimpanan selama satu bulan. Presentase pergeseran
viskositas dihitung dengan cara selisih viskositas setelah satu bulan penyimpanan dan viskositas setelah 48 jam pendiaman dibandingkan
viskositas setelah 48 pendiaman dikalikan 100. Pergeseran viskositas yang dikehendaki dalam penelitian ini adalah kurang dari 10.
8. Uji Antimikroba Emulgel terhadap
Staphyloccus epidermidis
a. Pembuatan stok bakteri Staphylococcus epidermidis. Media Muller Hinton Agar MHA dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL,
kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit. Selanjutnya dimiringkan dan dibiarkan memadat.
Diambil 1 ose biakan murni Staphylococcus epidermidis dan diinokulasikan secara goresan zig-zag, kemudian diinkubasi selama 48 jam
pada suhu 37
o
C dalam inkubator. b. Pembuatan suspensi Staphylococcus epidermidis. Diambil 1 ose koloni
bakteri Staphylococcus epidermidis dari stok bakteri, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi media Mueller Hinton Broth MHB
steril, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37
o
C dalam inkubator, selanjutnya kekeruhan suspensi bakteri Staphylococcus
epidermidis disesuaikan dengan standar 0,5 Mac Farland 1,5 x 10
8
CFUmL. c. Pembuatan kontrol media. Media MHA steril dituang ke dalam cawan
petri, dan ditunggu hingga memadat, kemudian diinkubasi selama 48 jam dengan suhu 37
o
C. Setelah diinkubasi, diamati, dan dibandingkan dengan perlakuan.
d. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Staphylococcus epidermidis. Dalam kondisi aseptis, suspensi bakteri dituangkan pada cawan petri,
kemudian ditambahkan media MHA steril dengan suhu 45-50
o
C, cawan petri digoyang sehingga pertumbuhan bakteri dapat merata. Cawan petri
tersebut kemudian diinkubasi selama 48 jam, dengan suhu 37
o
C. Setelah diinkubasi, diamati pertumbuhan bakteri uji melalui kekeruhan media dan
dibandingkan dengan perlakuan. e. Uji daya antibakteri emulgel terhadap Staphylococcus epidermidis. Dalam
kondisi aseptis, suspensi bakteri dituangkan pada cawan petri, kemudian ditambahkan media MHA steril dengan suhu 45-50
o
C, cawan petri digoyang sehingga pertumbuhan bakteri dapat merata. Media dibiarkan
memadat kemudian dilakukan pelobangan sampai ke dasar dan penambalan kembali dengan media untuk memberikan sejumlah ruang
bagi sediaan single layer method. Lubang sumuran yang dibuat berjumlah 5, masing-masing diisi dengan emulgel formula 1, formula a,
formula b, formula ab, dan kontrol basis. Cawan petri tersebut kemudian diinkubasi selama 48 jam dengan suhu 37
o
C. Kemudian diukur diameter zona hambat yang dihasilkan. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
F. Analisis Hasil
Aplikasi program R-2.14.1 digunakan sebagai alat untuk melakukan uji statistika pada penelitian ini. Pada uji sifat fisik dan stabilitas emulgel,
besarnya pengaruh lama dan kecepatan putar pada proses pencampuran dapat dihitung dengan metode desain faktorial menggunakan uji statistik two-way
ANOVA. Uji two-way ANOVA ini dapat dilakukan apabila data yang didapatkan
terdistribusi normal. Analisis data dilakukan untuk mengetahui signifikansi pengaruh lama, kecepatan putar, dan interaksi keduanya sehingga dapat diketahui
faktor yang dominan dalam menentukan sifat fisik dan stabilitas fisik emulgel. Dengan tingkat kepercayaan 95, maka faktor dikatakan berpengaruh jika nilai p
probability value kurang dari 0,05. Apabila data terdistribusi tidak normal, analisis yang dapat dilakukan
adalah uji nonparametrik Mann-WhitneyWilcoxon rank sum test dengan membandingkan dua formula yang memiliki satu nilai variabel lama
pencampuran atau kecepatan putar yang berbeda. Dengan tingkat kepercayaan 95, maka jika nilai p0,05 dapat disimpulkan jika terdapat perbedaan antara dua
formula, sebaliknya apabila nilai p0,05 dapat disimpulkan jika tidak terdapat perbedaan antara dua formula. Perbedaan kedua formula dapat menunjukkan
adanya pengaruh dari nilai variabel yang berbeda tersebut. Pada uji aktivitas antimikroba emulgel, untuk mengetahui ada tidaknya
perbedaan zona hambat antara kontrol basis dan keempat formula yang dibuat, digunakan uji one-way ANOVA atau uji Kruskal-Wallis terhadap formula 1,
formula a, formula b, formula ab, dan kontrol basis. Uji one-way ANOVA digunakan apabila distribusi data normal, sedangkan uji Kruskal Wallis digunakan
apabila distribusi datanya tidak normal. Dengan tingkat kepercayaan 95, maka jika didapatkan hasil p0,05 diambil kesimpulan bahwa paling tidak terdapat
perbedaan zona hambat pada dua kelompok formula, sebaliknya apabila didapatkan hasil p0,05 dapat disimpulkan jika tidak terdapat perbedaan antara
tiap-tiap formula Dahlan, 2008.
Untuk mengetahui kelompok mana yang mempunyai perbedaan, maka dilakukan analisis Post Hoc. Analisis Post Hoc untuk uji one-way ANOVA adalah
dengan uji T dan untuk uji Kruskal-Wallis adalah uji Mann-WhitneyWilcoxon rank sum test.
Selanjutnya diamati perbedaan zona hambat dari keempat formula untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh lama dan kecepatan putar proses
pencampuran terhadap zona hambat emulgel terhadap Staphylococcus epidermidis. Uji yang dilakukan adalah dengan menggunakan uji one-way
ANOVA atau uji Kruskal-Wallis terhadap formula 1, formula a, formula b, dan formula ab.
34
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Identifikasi dan Verifikasi Minyak Cengkeh
Penelitian ini menggunakan minyak cengkeh Eugenia caryophyllata Thunb. yang diperoleh dari CV Indaroma, Yogyakarta. Identifikasi dibuktikan
dengan Certificate of Analysis CoA yang terlampir di Lampiran 1. Identifikasi dilakukan dengan pengamatan organoleptis, yang meliputi:
bentuk, warna, dan bau. Minyak cengkeh berwujud cair, berwarna kuning jernih, dan berbau khas aromatik cengkeh.
Verifikasi minyak cengkeh diperlukan untuk memastikan kebenaran identitas minyak cengkeh yang digunakan. Verifikasi yang dilakukan berupa
penetapan bobot jenis dan indeks bias. Hasil verifikasi minyak cengkeh adalah sebagai berikut:
Tabel III. Hasil verifikasi sifat fisik minyak cengkeh
Sifat fisik Literatur
Parthasarathy, 2008
CoA Hasil verifikasi
Bobot jenis 1,040 - 1,054
25 C
1,010 – 1,035 1,0207 ± 0,0021
25 C
Indeks bias 1,5231 – 1,5338
20 C
1,520 – 1,540 1,534 ± 1,00 20
C
Hasil tersebut menunjukkan bahwa verifikasi indeks bias pada suhu 20
C sesuai dengan nilai indeks bias pada suhu 20 C dari studi pustaka yang
didapatkan Parthasarathy, 2008 dan CoA. Namun, hasil verifikasi bobot jenis tidak masuk dalam range bobot jenis dari studi pustaka yang didapat. Hal ini
Kategori