55
mengandung senyawa-senyawa yang dapat bekerja sinergis membentuk apoptosis atau bahkan menghambat apoptosis. Meskipun demikian, berdasarkan penelitian
ini dapat dikatakan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah dapat menginduksi apoptosis pada sel WiDr.
D. Uji Penekanan Ekspresi COX-2 oleh Ekstrak Etanol Daun Sirih
Merah dengan Metode Imunositokimia
Kemampuan ekstrak etanol daun sirih merah dalam menekan ekspresi COX-2 dapat diketahui dengan metode imunositokimia. Prinsip dari metode
imunositokimia ini adalah adanya pengikatan antigen pada antibodi yang dilekatkan dengan suatu penanda yang beraksi dengan kromogen DAB
diaminobenzidin sehingga menjadi substrat berwarna cokelat. Antibodi primer yang digunakan pada penelitian ini adalah antibodi monoklonal primer COX-2.
Antibodi ini berikatan dengan reseptor COX-2 yang ada di sel kanker kolon WiDr sehingga sel yang mengekspresikan COX-2 berwarna coklat ketika diberi pewarna
DAB dari reagen imunositokimia. Visualisasi warna yang dihasilkan dari ekspresi COX-2 dapat memberikan gambaran kualitatif maupun gambaran kuantitatif The
Human Protein Atlas, 2015. Pengamatan ekspresi COX-2 secara kualitatif, dapat dilihat dari warna
yang dihasilkan pada sel WiDr. Pewarnaan secara enzimatis oleh peroksidase menyebabkan adanya warna yang berbeda antara sel yang mengekspresikan COX-
2 dan sel yang tidak mengekspresikan COX-2. Sel yang mengekspresikan COX-2 akan berwarna kecokelatan yang pekat atau gelap ditandai dengan tanda panah
56
warna biru cerah sedangkan sel yang tidak mengekspresikan COX-2 akan berwarna keunguan ditandai dengan tanda panah warna merah Gambar 12.
Pada sel WiDr yang telah diberi perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah Gambar 12B, jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 semakin sedikit
dibandingkan dengan jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 pada kontrol sel Gambar 12A, Pada sel WiDr yang diberi perlakuan dengan doksorubisin
Gambar 12D Immanuel, 2015, penurunan jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 lebih banyak dibandingkan dengan kelompok ekstrak dan kontrol sel,
sehingga dari penelitian ini disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah dapat menekan ekspresi COX-2 pada sel WiDr walaupun tidak sebesar
doksorubisin.
Gambar 12. Gambaran ekspresi COX-2 pada sel kanker WiDr. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 40x10. A kontrol sel dengan antibodi COX-2,
B pemberian ekstrak etanol daun sirih merah dengan konsentrasi 727 µgmL, C kontrol sel tanpa antibodi COX-2, dan D doksorubisin dengan antibodi COX-2 Immanuel, 2015.
Sel yang mengekspresikan protein COX-2 ditandai dengan anak panah berwarna biru dan sel yang tidak mengekspresikan protein COX-2 ditandai dengan anak panah berwarna
merah B
A
C D
57
Tabel 2. Jumlah rata-rata sel yang mengekspresikan COX-2 pada kelompok perlakuan, kontrol sel, dan doksorubisin Immanuel, 2015.
Preparat Rata-rata ± SD
Skor
Kontrol sel 56,88 ± 5,17
3+ Perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah
37,07 ± 1,87 2+
Doksorubisin Immanuel, 2015 34,32 ± 2,57
2+ Ket : Skor 1- = rata-rata jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 kurang dari 10; Skor 1+ =
rata-rata jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 lebih dari 10 sampai 25; skor 2+ = rata- rata jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 lebih dari 25 sampai 50; skor 3+ = rata-rata
jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 lebih dari 50 sampai 75; dan skor 4+ = rata-rata jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 lebih dari 75 sampai 90.
Tabel 3. Hasil uji statistik kebermaknaan antara kelompok perlakuan dengan kontrol sel dan doksorubsin Immanuel, 2015.
Perlakuan yang diberikan Kontrol Sel
Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah
Doksorubisin
Kontrol Sel BB
Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah BB
BTB Doksorubisin Immanuel, 2015
BB BTB
Ket : BB = Berbeda Bermakna BTB = Berbeda Tidak Bermakna
Pengamatan ekspresi protein COX-2 secara semikuantitatif bertujuan untuk mengetahui persentase penekanan ekspresi protein COX-2 dan nilai skor
persentase sel yang mengekspresikan COX-2 setelah diberikan perlakuan dengan ekstrak etanol daun sirih merah. Hasil perhitungan jumlah rata-rata sel yang
mengekspresikan protein COX-2 pada penelitian ini Tabel 2, dapat dilihat bahwa
kelompok perlakuan
memberikan rata-rata
jumlah sel
yang mengekspresikan COX-2 lebih kecil 37,07± 1,87 dengan skor ekspresi COX-2
2+ dibandingkan dengan kontrol sel 56,88 ± 5,17 dengan skor ekspresi COX-2 3+. Ekspresi COX-2 pada sel WiDr akibat perlakuan dengan ekstrak juga
dibandingkan dengan ekspresi COX-2 pada sel WiDr setelah pemberian doksorubisin. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Immanuel 2015, rata-
rata jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 doksorubisin mendekati rata-rata
58
jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 akibat ekstrak yaitu sebesar 34,32 ± 4,24 dengan skor COX-2 2+. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun
sirih merah dapat menurunkan ekspresi COX-2 pada sel WiDr walaupun tidak sebesar doksorubisin.
Analisis data persentase penekanan ekspresi protein COX-2 pada masing- masing kelompok perlakuan dan kontrol sel dilakukan secara statistik Lampiran
6. Berdasarkan analisis t- berpasangan α = 0,05, didapatkan perbedaan yang
bermakna antara jumlah sel yang mengekspresikan protein COX-2 pada kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol sel. Jika dibandingkan antara jumlah sel yang
mengekspresikan protein COX-2 pada kelompok perlakuan dengan doksorubisin Immanuel, 2015, didapatkan perbedaan yang tidak bermakna Tabel 3,
sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah mempunyai kemampuan untuk menekan ekspresi protein COX-2 pada sel kanker WiDr.
Peningkatan ekspresi COX-2 pada kanker kolon dapat dijadikan sebagai molekul target dalam menskrining senyawa sitotoksik. Senyawa sitotoksik apa
yang terkandung dalam ekstrak etanol daun sirih merah yang bertanggung jawab terhadap penekanan ekspresi COX-2 belum diteliti lebih lanjut, namun diduga
senyawa flavonoid yang terkandung dalam ekstrak etanol daun sirih merah dapat menekan ekspresi protein COX-2. Peningkatan ekspresi COX-2 yang berlebih
pada sel kanker kolon diketahui dapat meningkatkan proliferasi sel dan memacu proses angiogenesis Nurrochmad, 2004. Menurut Nijveldt et al., 2001,
flavonoid memiliki efek sebagai antiangiogenesis yang dapat mencegah proliferasi dan migrasi sel endotel serta pembentukan lumen. Mekanisme
59
flavonoid dalam mencegah proses angiogenesis masih belum diteliti lebih lanjut, namun diduga diperantai oleh adanya penghambatan protein kinase yang berperan
dalam tranduksi sinyal pada proses angiogenesis. Aktivitas daun sirih merah dalam menghambat proses angiogenesis juga didukung oleh penelitian yang
dilakukan Lendra 2014 yang menguji aktivitas antiangiogenesis ekstrak etanol daun sirih merah terhadap chorioallantoic membrane yang diinduksi bFGF. Fraksi
aktif apa yang terkandung dalam ekstrak etanol daun sirih merah yang memiliki aktivitas untuk menekan ekspresi COX-2 perlu dilakukan penelitian lebih lanjut,
sehingga diharapkan dapat melengkapi bukti-bukti ilmiah mengenai aktivitas daun sirih merah sebagai antikanker.
60
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
