36
pertama menggunakan shaker. Maserat diambil dan disaring menggunakan kertas saring setelah direndam selama 24 jam. Maserat ditampung dalam
tabung erlenmeyer bertutup dan kemudian disimpan terlindung dari cahaya matahari. Ampas serbuk daun sirih merah yang tertinggal kemudian diperas
dan direndam kembali dalam 1000 mL etanol 70 dalam erlenmeyer bertutup. Perendaman dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari sambil
diaduk selama 6 jam pertama menggunakan shaker. Maserat diambil dan disaring kembali menggunakan kertas saring setelah 24 jam direndamlalu
digabungkan dengan maserat sebelumnya. Maserat yang terkumpul kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator. Hasil evaporasi dituang ke dalam cawan
porselen kemudian dipanaskan di atas waterbath dengan suhu 80 C untuk
mendapatkan ekstrak etanol daun sirih merah yang kental.
4. Uji sitotoksisitas ekstrak etanol daun sirih merah dengan metode MTT
a. Preparasi sel kanker kolon WiDr. Sel WiDr diambil dari tangki nitrogen dan
segera dicairkan dalam penangas air dengan suhu 37 C. Ampul disemprot
dengan etanol 70 dan dimasukkan dalam LAF. Sel WiDr dipindahkan dari dalam ampul ke dalam conical tube steril yang telah berisi medium kultur
lengkap mengandung penisilin-streptomisin 1 vv, FBS 10 vv, Fungizone 0,5, dan media RPMI 1640. Suspensi sel WiDr disentrifugasi
dengan kecepatan 650 rpm selama 3 menit dan supernatan yang terbentuk dibuang. Medium kultur lengkap yang baru ditambahkan kembali kedalam
suspensi sel dan disentrifugasi perlahan hingga homogen. Sel WiDr kemudian ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam
37
inkubator CO
2
dengan suhu 37 C selama 24 jam. Medium kultur lengkap
diganti setelah 24 jam dan sel WiDr ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian. Medium kultur dibuang kembali setelah sel
WiDr konfluen dan kemudian sel WiDr dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali. Tripsin-EDTA 0,25 ditambahkan dalam sel WiDr dan dilakukan inkubasi
selama 3 menit dalam inkubator CO
2
. Sebanyak kurang lebih 5 mL medium kultur lengkap ditambahkan kembali dan sel WiDr diresuspensikan hingga
terlepas semua dari dinding flask. Suspensi sel dipindahkan ke dalam conical tube steril baru. Sel WiDr dihitung dengan hemocytometer dan cell counter.
Kultur sel WiDr yang telah konfluen dipanen dengan tripsin EDTA dan didistribusikan ke dalam 96-well plate, masing-masing sebanyak 100 µL.
Setiap mengisi 12 sumuran, resuspensi kembali sel WiDr agar tetap homogen. Sebanyak 3 sumuran 96-well plate dikosongkan tidak diisi sel sebagai kontrol
media. Sel WiDr diinkubasi di dalam inkubator selama 24 jam agar sel WiDr
beradaptasi dan menempel di sumuran sehingga siap untuk perlakuan.
b. Preparasi larutan uji ekstrak daun sirih merah. Sebanyak kurang lebih 50 mg
ekstrak daun sirih merah ditimbang dan dimasukkan dalam eppendorf. Ekstrak daun sirih merah kemudian dilarutkan dalam 500 µL DMSO dan divortek
hingga homogen untuk mendapatkan larutan ekstrak induk dengan konsentrasi 100.000 µgmL. Larutan induk diencerkan dengan medium kultur lengkap
yang sebelumnya sudah di lakukan optimasi sehingga diperoleh seri konsentrasi sebesar 1 µgmL; 10 µgmL; 100 µgmL; 500 µgmL; 1000 µ gmL;
2000 µgmL; dan 4000 µgmL.
38
c. Perlakuan uji sitotoksik dengan MTT assay. Sel WiDr dalam 96-well plate
diambil dari inkubator. Keadaan dan distribusi sel WiDr diamati dengan menggunakan mikroskop kemudian didokumentasikan. Medium dalam
sumuran dibuang dengan membalikkan plate 180 diatas tempat pembuangan
lalu sisa cairan pada plate ditiriskan di atas tisu. Sumuran dicuci dengan 100 µL PBS lalu PBS dibuang dengan cara membalik plate dan sisa cairan
ditiriskan dengan tisu. Sebanyak 100 µL seri konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah dengan kadar 1 µgmL; 10 µgmL; 100 µgmL; 500 µgmL; 1000
µgmL; 2000 µgmL; dan 4000 µgmL dimasukkan ke dalam 96-well plate. Sebanyak 100 µL medium kultur lengkap juga dimasukkan pada 3 sumuran
yang telah dikosongkan sebagai kontrol media kemudian diinkubasikan di dalam inkubator selama 24 jam. Menjelang akhir inkubasi, kondisi sel
didokumentasikan terlebih dahulu. Media sel kemudian dibuang dengan membalikkan plate diatas tempat pembuangan lalu sisa cairan pada plate
ditiriskan di atas tisu. Sumuran dicuci dengan 100 µL PBS lalu PBS dibuang dengan cara membalik plate dan sisa cairan ditiriskan dengan tisu. Sebanyak
100 µL reagen MTT ditambahkan ke dalam setiap sumuran termasuk kontrol media, kemudian diinkubasikan selama 3 jam dalam inkubator. Kondisi sel
WiDr diperiksa dengan mikroskop inverted jika telah terbentuk formazan. Sebanyak 100 µL larutan stopper berupa SDS 10 dalam 0,1 N HCl
ditambahkan ke dalam sumuran. Plate kemudian dibungkus dengan kertas atau aluminuium foil lalu diinkubasikan di tempat gelap selama semalaman pada
suhu ruangan. Absorbansi masing-masing sumuran dibaca dengan
39
menggunakan ELISA reader pada = 595 nm. Persentase sel hidup kemudian
dihitung dan dilakukan analisis harga IC
50.
5. Uji apoptosis ekstrak etanol daun sirih merah dengan metode double
