32
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian mengenai pengaruh ekstrak etanol daun sirih merah pada sel WiDr merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan menggunakan
rancangan acak lengkap pola searah.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel utama
a. Variabel bebas. Variabel bebas dari penelitian ini adalah besarnya konsentrasi
ekstrak etanol daun sirih merah pada sel kanker kolon WiDr.
b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dari penelitian ini adalah viabilitas sel
WiDr yang diukur dengan nilai IC
50
ekstrak etanol daun sirih merah, distribusi
kematian sel, dan penekanan ekspresi COX-2. 2.
Variabel pengacau
a.
Variabel pengacau terkendali
1 Waktu dan tempat pengambilan daun sirih merah yaitu di Dusun Bedingin,
Desa Sumber Adi, Kecamatan Mlati, Kabupaten Sleman, Yogyakarta, pada
bulan Juli 2014.
2 Kondisi dan tempat dilakukan penelitian yaitu di Laboratorium Parasitologi,
Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
33
3 Kondisi sel kanker kolon WiDr yang digunakan yaitu dalam keadaan 80
konfluen, tercukupi nutrisinya, dan bebas dari kontaminasi.
b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali dalam
penelitian ini adalah umur, tempat tumbuh, jenis dan jumlah kandungan kimia daun sirih merah.
3. Definisi operasional
a. Ekstrak etanol daun sirih merah adalah ekstrak kental daun sirih merah yang
diperoleh dengan cara maserasi sebanyak dua kali meggunakan pelarut etanol
70
b. Sel WiDr adalah sel model kanker kolon yang diisolasi dari kolon manusia
yang mengekspresikan protein COX-2 secara berlebih.
c. Uji sitotoksik MTT adalah metode yang digunakan untuk mengetahui
persentase viabilitas sel WiDr setelah pemberian ekstrak etanol daun sirih merah dan dinyatakan dalam parameter IC
50
Inhibition Concentration 50
d. Uji apoptosis double staining adalah metode uji dengan menggunakan reagen
etidium bromide-akridin oranye untuk memvisualisasikan kematian sel WiDr.
e. Ekspresi siklooksigenase-2 COX-2 adalah protein yang diekspresikan oleh
sel WiDr yang ditunjukkan dengan warna cokelat pada sitoplasma sel.
f. Imunositokimia adalah metode uji untuk mengetahui skor ekspresi COX-2
pada sel WiDr setelah pemberian ekstrak etanol daun sirih merah
34
C. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu daun sirih merah diperoleh dari Sleman, Yogyakarta; sel WiDr diperoleh dari Laboratorium
Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada; pelarut DMSO Merck; etanol 70 Merck; medium kultur lengkapyang mengandung
penisilin-streptomisin 1 vv Gibco, Fetal Bovine Serum FBS 10 vv Gibco, Fungizone 0,5 Gibco, dan media Rosswell Park Memorial Institute
RPMI 1640 Gibco; Tripsin-EDTA 0,25; reagen MTT [3-4,5-dimetiltiazol- 2-il-2,5difeniltetrazoliumbromida] Bio Basic Canada Inc; larutan Phoshat
Buffer Saline PBS pH 7,4; larutan stopper berupa sodium deodesil sulfat SDS 10 dalam 0,1 N HCl; reagen etidium bromida-akridin oranye EtBr-AO
Sigma, antibodi primer COX-2 rabbit monoclonal Lab Vision Corp., antibodi sekunder Trekkie Universal Link Anti Mouse and Rabbit ter-biotinylated, larutan
DBA, reagen streptavidin Trek Avidin-HRP label, metanol, larutan hidrogen peroksidase blocking solution, aquades, larutan Maye Haemotoxylin, alkohol,
xylol, dan Tripsin 0,5 Gibco,
D. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : alat-alat gelas PYREX, timbangan analitik, aluminium foil Klin Pak, vortek, waterbath
Memmert, rotary vacuum evaporator Buchi Labortechnik AG CH-9230, tabung conical Iwaki, inkubator CO
2
Thermo Heraeus HeraCell 150, mikropipet Gilson, cover slip Citoglas Brand, shaker, pinset, jarum, object
35
glass, cell counter, 96-well plate Iwaki, 24-well plate Iwaki, pipet Pasteur, ELISA reader Bio-Rad, laminar air flow cabinet Labconco, mikroskop
inverted Olympus, mikroskop flourosens Zeiss MC 80, kamera digital Canon DSLR 1000D, haemocytometer Neubauer, yellow tips, blue tips, eppendorf
Plasti brand, tissue, glove,pinset, dan masker.
E. Tata Cara Penelitian
Kategori