39
menggunakan ELISA reader pada = 595 nm. Persentase sel hidup kemudian
dihitung dan dilakukan analisis harga IC
50.
5. Uji apoptosis ekstrak etanol daun sirih merah dengan metode double
staining
a. Preparasi sel WiDr. Sel WiDr yang sudah konfluen diambil dan dipanen dari
dalam inkubator CO
2.
Coverslip dimasukkan kedalam 24-well plate menggunakan pinset dengan hati-hati. Sebanyak 1000 µL suspensi sel
dimasukkan tepat diatas coverslip secara merata dan perlahan. Keadaan dan distribusi sel WiDr diamati dengan menggunakan mikroskop lalu
didokumentasikan. Sel WiDr kemudian diinkubasikan dalam inkubator selama semalam. Satu konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah dengan kadar 727
ugmL sebagai perlakuan dan 1 kontrol sel WiDr dibuat, masing-masing
sebanyak 1000 µL.
b. Perlakuan Double Staining Sampel pada Sel WiDr. Sel WiDr dalam 24-well
plate diambil dari inkubator. Semua medium kultur lengkap dari sumuran dibuang dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan. Sel WiDr dalam sumuran
dicuci dengan 500 µL PBS. PBS dibuang dari sumuran dengan pipet Pasteur secara perlahan. Sebanyak 1000 µL larutan uji ekstrak etanol daun sirih merah
dengan konsentrasi 727 µgmL dan medium kultur lengkap sebagai kontrol sel dimasukkan kedalam sumuran. Sel diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam.
Semua media dari sumuran dibuang kemudian dicuci masing-masing dengan 500 µL PBS. PBS dibuang dan coverslip diambil menggunakan pinset dengan
bantuan ujung jarum dengan hati-hati. Coverslip diletakkan di atas object glass
40
kaca obyek dan diberi label. Sebanyak 10 µL reagen campuran etidium bromida-akridin oranye diteteskan di atas coverslip dan diratakan dengan cara
menggoyangnya secara perlahan, kemudian diamati di bawah mikroskop
fluoresen dan didokumentasikan. 6.
Pengamatan ekspresi COX-2 dengan metode imunositokimia
a. Preparasi sel WiDr. Sel WiDr yang sudah konfluen diambil dan dipanen dari
inkubator CO
2
. Coverslip dimasukkan kedalam 24-well plate menggunakan pinset dengan hati-hati. Sebanyak 1000 µL suspensi sel WiDr dimasukan tepat
diatas coverslip secara merata dan perlahan. Keadaan dan distribusi sel WiDr diamati dengan menggunakan mikroskop lalu didokumentasikan. Sel WiDr
kemudian diinkubasikan dalam inkubator selama semalam. Satu konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah dengan kadar 727 ugmL sebagai perlakuan
dan 1 kontrol sel WiDr dibuat, masing-masing sebanyak 1000 µL.
b. Perlakuan uji imunositokimia ekstrak etanol daun sirih merah pada sel kanker
WiDr. Sel WiDr dalam 24-well plate diambil dari inkubator. Semua medium kultur dari sumuran dibuang dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan. Sel
WiDr dalam sumuran dicuci dengan 500 µL PBS. PBS dibuang dari sumuran dengan pipet Pasteur secara perlahan. Sebanyak 1000 µL larutan uji ekstrak
etanol daun sirih merah dengan konsentrasi 727 µgmL dan medium kultur lengkap sebagai kontrol sel dimasukkan kedalam sumuran. Sel diinkubasi
dalam inkubator selama 24 jam. Semua media dibuang dari sumuran dan masing-masing dicuci dengan 500 µL PBS. PBS dibuang kembali dan
sebanyak 300 µL metanol dimasukkan kemudian diinkubasi selama 10 menit.
41
Metanol dibuang secara perlahan kemudian dicuci dengan 500 µL PBS dan 500 µL aquadest. Larutan hidrogen peroksida blocking solution diteteskan
kemudian diinkubasi selama 20 menit. Larutan dibuang dengan mikropipet Prediluted blocking serum diteteskan dan diinkubasi selama 15 menit
kemudian larutan dibuang. Antibodi primer yaitu COX-2 rabbit monoclonal di teteskan dan diinkubasikan selama 60 menit. Sebanyak 500 µL PBS
ditambahkan dalam sumuran lalu diinkubasi selama 5 menit. PBS dibuang dan antibodi sekunder yaitu Trekkie Universal Link Anti Mouse and Rabbit ter-
biotinylated diteteskan kemudian diinkubasi selama 20 menit. Sebanyak 500 µL PBS ditambahkan dan diinkubasi selama 5 menit. PBS dibuang kembali
kemudian reagen streptavidin Trek Avidin-HRP label diteteskan dan diinkubasi selama 10 menit. Larutan Betazoid DAB diteteskan dan
diinkubasikan selama 15 menit. Sebanyak 500 µL akuades ditambahkan, kemudian dibuang. Larutan MayeHaemotoxylin diteteskan dan diinkubasi
selama 3 menit. Sebanyak 500 µL akuades ditambahkan lalu dibuang kembali. Coverslip diangkat dengan pinset secara hati-hati dan kemudian dicelupkan
dalam xylol dan alkohol. Coverslip dikeringkan dan diletakkan di atas object glass, kemudian ditetesi dengan lem mounting media. Coverslip ditutup
dengan coverslip kotak kemudian ekspresi protein diamati dengan mikroskop
cahaya.
42
F. Tata Cara Analisis Hasil
