47
flavonoid melainkan juga mengekstraksi klorofil yang ada di dalam daun sirih merah.
B. Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah dengan MTT assay
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak etanol daun sirih merah dalam menghambat sel WiDr secara in vitro dengan menentukan nilai
IC
50
. Pelarut DMSO dimetil sulfoksida digunakan untuk membuat larutan uji sampel karena DMSO telah digunakan secara luas untuk melarutkan senyawa
polar maupun non polar dan tidak bersifat sitotoksik. Menurut penelitian Violante et al., 2002, tidak ditemukan adanya efek sitotoksik DMSO dengan kadar diatas
10 pada sel CaCO
2
TC7. Menurut FDA, DMSO dikategorikan sebagai pelarut kelas tiga yang memiliki resiko toksik lebih rendah pada manusia Gaylord
C hemical’s, 2015.
Penelitian aktivitas sitotoksik ekstrak etanol daun sirih merah terhadap viabilitas sel WiDr dilakukan dengan menggunakan metode MTT. Metode ini
dipilih karena memiliki ketepatan yang tinggi, cukup aman, sederhana, dan cepat Freshney, 2000. Prinsip dari metode MTT adalah terjadinya reduksi garam
kuning tetrazolium
MTT 3-4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazolium
bromida menjadi kristal formazan berwarna ungu oleh enzim suksinat dehidrogenase yang terdapat dalam jalur respirasi sel pada mitokondria
Rahmawati, Sukardiman, and Muti, 2013. Reaksi antara MTT dengan enzim reduktase suksinat tetrazolium merupakan reaksi enzimatis yang berlangsung
continue sehingga diperlukan larutan stopper SDS 10 dalam HCl 0,01N untuk
48
menghentikan reaksi tersebut. Pada kelompok perlakuan, sel WiDr yang hidup ditandai dengan terbentuknya kristal formazan berwarna ungu, sedangkan sel
WiDr yang mati tidak menimbulkan perubahan warna. Intensitas warna ungu yang dihasilkan semakin bertambah seiring dengan menurunnya konsentrasi ekstrak
yang dihasilkan Lampiran 3. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah mempunyai potensi dalam penghambatan pertumbuhan sel WiDr.
Kristal formazan ungu yang larut dalam SDS kemudian diukur absorbansinya dan disajikan dalam bentuk grafik viabilitas sel dengan
konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah Gambar 9. Berdasarkan grafik tersebut, aktivitas ekstrak etanol daun sirih merah menunjukkan pola dose-
dependent, yaitu viabilitas sel berkurang seiring bertambahnya konsentrasi ekstrak. Penentuan nilai IC
50
pada penelitian ini dilakukan dengan regresi linier pada 5 titik pada konsentrasi yaitu 10 µgmL, 100 µgmL, 500 µgmL, 1000
µgmL, dan 2000 µgmL sehingga didapatkan persamaan linear y = -0,045x + 82,73 dengan R
2
= 0,991. Berdasarkan persamaan linear ini didapatkan nilai IC
50
ekstrak etanol daun sirih merah sebesar 727 µgmL. Menurut National Cancer Institute NCI suatu ekstrak dinyatakan aktif memiliki aktivitas antikanker
apabila memiliki nilai IC
50
30 µgmL, moderate aktif apabila memiliki 30 µgmL ≤ IC
50
100 µgmL, dan tidak aktif apabila nilai IC
50
100 µgmL Zheng et al., 2000. Oleh karena itu, berdasarkan kriteria yang ditetapkan oleh NCI, dapat
dikatakan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah pada penelitian ini tidak menunjukkan aktivitas sitotoksik yang poten terhadap sel WiDr. Nilai IC
50
ekstrak etanolik daun sirih merah juga dibandingkan dengan nilai IC
50
doksorubisin pada
49
sel WiDr yaitu sebesar 21,44 µgmL Immanuel, 2015. Berdasarkan perbandingan tersebut, dapat dikatakan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah
memiliki aktivitas sitotoksik yang lebih rendah dibandingkan dengan doksorubisin.
Gambar 9. Grafik hubungan viabilitas sel dengan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah
Gambar 10. Morfologi sel WiDr yang diamati dibawah mikroskop inverted dengan
perbesaran 400x. Keterangan : A ekstrak etanol daun sirih merah dengan konsentrasi 4000 µgmL, B ekstrak etanol daun sirih merah dengan konsentrasi 2000 µgmL, C ekstrak
etanol daun sirih merah dengan konsentrasi 1 µgmL, D kontrol sel, dan E doksorubisin dengan konsentrasi 80 µgmL Immanuel, 2015. Sel hidup , sel mati
-20 20
40 60
80 100
-1000 1000
2000 3000
4000
v iab
il itas
sel
Konsentasi ekstrak etanol daun sirih merah µgmL
A B
C
D E
50
Nilai IC
50
ekstrak etanol daun sirih merah yang besar diduga karena kompleksisitas senyawa yang terkandung didalam ekstrak tersebut. Daun sirih
merah diketahui memiliki senyawa antioksidan yang berfungsi mencegah stres oksidatif dan kerusakan DNA Alfarabi et al., 2010, tetapi menurut penelitian
yang dilakukan oleh Sayin et al., 2014, senyawa antioksidan juga dapat berfungsi sebagai agen karsinogen. Antioksidan diduga dapat mengurangi
ekspresi gen p53 gen penekan tumor sehingga proliferasi sel WiDr yang diketahui telah mengalami mutasi pada gen tersebut dapat semakin meningkat.
Aktivitas sitotoksik ekstrak etanol daun sirih merah terhadap sel WiDr juga memberikan pengaruh pada morfologi sel setelah 24 jam perlakuan. Gambar
10D menunjukkan populasi sel WiDr pada kelompok kontrol yang berbentuk bulat, menempel satu dengan yang lain dan menempel di dasar plate, serta
memiliki warna yang lebih cerah karena masih mengandung cairan sitoplasma yang dapat meneruskan cahaya dari mikroskop inverted. Pada konsentrasi ekstrak
4000 µgmL Gambar 10A, morfologi sel WiDr tidak dapat teramati karena tertutup oleh sampel yang pekat. Pada konsentrasi ekstrak 2000 µgmL Gambar
10B, sel WiDr yang mati terlihat lebih gelap, kepadatan sel berkurang, dan sel terlihat mengambang tidak menempel pada dasar plate, sedangkan pada
konsentrasi 1 µgmL gambar 10C, kepadatan populasi mendekati kepadatan kontrol sel yang menandakan viabilitas sel masih tinggi. Morfologi sel WiDr yang
diberi perlakuan dengan doksorubisin Immanuel, 2015 juga menunjukkan hasil yang sama dengan morfologi sel yang diberi perlakuan dengan ekstrak etanol
51
daun sirih merah pada konsentrasi 2000 µgmL yaitu kepadatan sel berkurang dan sel terlihat mengambang.
Penentuan nilai IC
50
dan pengamatan perubahan morfologi sel WiDr dalam uji sitotoksik belum cukup digunakan sebagai dasar untuk menjelaskan
mekanisme sitotoksisitas ekstrak etanol daun sirih merah, sehingga perlu dianalisis lebih lanjut dengan uji double staining dan imunositokimia.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Awik, Sukardiman, and Tri 2011 yang menguji sitotoksisitas ekstrak spons laut Aaptos suberitoides terhadap sel
kanker payudara T47D, juga dihasilkan nilai IC
50
yang besar yaitu 528,82 gmL dan dilanjutkan dengan pengujian double staining dan imunositokimia.
C. Uji Apoptosis Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah dengan
Kategori