51
daun sirih merah pada konsentrasi 2000 µgmL yaitu kepadatan sel berkurang dan sel terlihat mengambang.
Penentuan nilai IC
50
dan pengamatan perubahan morfologi sel WiDr dalam uji sitotoksik belum cukup digunakan sebagai dasar untuk menjelaskan
mekanisme sitotoksisitas ekstrak etanol daun sirih merah, sehingga perlu dianalisis lebih lanjut dengan uji double staining dan imunositokimia.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Awik, Sukardiman, and Tri 2011 yang menguji sitotoksisitas ekstrak spons laut Aaptos suberitoides terhadap sel
kanker payudara T47D, juga dihasilkan nilai IC
50
yang besar yaitu 528,82 gmL dan dilanjutkan dengan pengujian double staining dan imunositokimia.
C. Uji Apoptosis Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah dengan
Metode Double Staining
Kematian sel WiDr melalui apoptosis akibat pelakuan dengan ekstrak etanol daun sirih merah dapat diketahui dengan metode double staining. Prinsip
dari metode double staining adalah adanya perbedaan warna fluorosen yang dihasilkan oleh sel hidup dan sel mati karena pengikatan etidium bromida-akridin
oranye. Kedua macam zat warna ini digunakan secara bersamaan karena dapat menghasilkan warna kontras, sehingga mempermudah pengamatan dibawah
mikroskop fluorosen. Akridin oranye dapat menembus seluruh bagian sel dan berikatan dengan DNA sel hidup sehingga nukleus sel akan tampak berwarna
hijau. Etidium bromida hanya dapat berinteraksi dengan sel yang membrannya sudah rusak dan juga berikatan dengan DNA sel sehingga nukleus berwarna
52
merah. Warna yang ditimbulkan oleh etidium bromida pada sel yang mati lebih dominan dibandingkan dengan akridin oranye, sehingga nukleus pada sel yang
mati akan berwarna oranye Maryati and Sutrisna, 2011. Pengamatan terhadap morfologi sel WiDr harus dilakukan dengan segera
setelah larutan etidium bromida-akridin oranye diteteskan, karena jika terlalu lama berinteraksi dengan sel, maka sel yang hidup akan mati. Menurut penelitian yang
dilakukan oleh Triana, Yulinery, and Nurhidayat 2014, etidium bromide bersifat toksik dan menyebabkan mutagenesis pada isolate M. purpureus. Etidium
bromida merupakan agen interkalasi yang memiliki stuktur menyerupai cincin pada basa-basa DNA sel dan bersifat hidrofobik. Etidium bromida akan menyisip
di antara basa-basa pada untai ganda DNA dengan membentuk ikatan van der Walls dan berikatan pada bagian hidrofobik molekul DNA, sehingga
mengakibatkan distorsi pada untai ganda danperubahan struktur molekul DNA. Kondisi ini dapat menyebabkan interferensi terhadap proses-proses yang
berlangsung pada DNA, misalnya replikasi dan transkripsi DNA, DNA repair, dan rekombinasi DNA Reha et al., 2003.
Uji apoptosis pada penelitian ini menggunakan ekstrak etanol daun sirih merah pada konsentrasi IC
50
sebesar 727 µgmL. Hasil pengamatan dibawah mikroskop fluoresen memperlihatkan bahwa sel WiDr yang mati akan
berflouresen oranye, sedangkan sel yang hidup akan berflouresen hijau Gambar 11. Pada kelompok kontrol Gambar 11A, membran sel WiDr masih dalam
keadaan utuh sehingga hanya akridin oranye yang dapat masuk kedalam sel hidup. Sel hidup dengan membran yang masih utuh memiliki nukleus dengan warna
53
hijau yang seragam sehingga flouresen yang ditimbulkan berwarna hijau. Pada kelompok kontrol juga terdapat sel WiDr yang mengalami apoptosis. Hal ini
menunjukan bahwa terjadi eliminasi sel WiDr yang rusak yang mungkin disebabkan karena adanya keadaan yang mengakibatkan stress pada sel. Pada
kelompok perlakuan Gambar 11B, tampak sel WiDr mengalami apoptosis. Peristiwa apoptosis terdiri dari tahap early apoptosis, late apoptosis, dan
fagositosis. Pada tahap early apoptosis terjadinya kondensasi kromatin pada inti sel dan sel mulai mengkerut. Hal ini menyebabkan mulai menurunnya integritas
dan permeabilitas membran sel WiDr sehingga etidium bromida dapat masuk kedalam sel dan menimbulkan fluoresen berwarna hijau terang pada inti sel. Pada
tahap late apoptosis, membran sel WiDr mulai terjadi blebbing dan terjadi fragmentasi DNA sel sehingga etidium bromida dapat masuk dan dihasilkannya
fluoresen berwarna oranye pada inti sel. Warna yang ditimbulkan oleh etidium bromida pada sel yang mati lebih dominan jika dibandingkan dengan akridin
oranye sehingga nukleus pada sel mati akan berwarna oranye Maryati and Sutrisna, 2011. Tidak semua sel WiDr pada kelompok perlakuan mengalami
aktivitas apoptosis karena juga dihasilkan fluoresen berwarna hijau, namun berdasarkan pengamatan morfologi sel WiDr penelitian ini disimpulkan bahwa
ekstrak etanol daun sirih merah dapat menginduksi apoptosis pada sel WiDr.
Tabel 1. Distribusi sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode
double staining Perlakuan
Apoptosis ±SD
Nekrosis ±SD
Hidup ± SD
Ekstrak etanol daun sirih merah
89,47±2,97 10,87±2,42
Kontrol Sel 0,37±0,38
99,60±0,37 Doksorubisin Immanuel, 2015
92,92±2,20 2,98±2,59
5,42±0,0005
54
Gambar 11. Efek perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah pada sel WiDr dengan menggunakan metode
double-staining. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop fluoresen dengan perbesaran 40x10. A Kontrol sel, B Sel yang mengalami apoptosis setelah diberi
perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah pada konsentrasi IC
50
sebesar 727 µgmL, dan C Sel yang mengalami apoptosis setelah diberi doksorubisin pada konsentrasi IC
50
sebesar 21 µgmL Immanuel, 2015. Sel hidup berflouresensi hijau . Sel yang mengalami
early apoptosis berflourensensi hijau terang . Sel yang mengalami late apoptosis berflourensensi oranye .
Berdasarkan hasil pengecatan ini, diperoleh persentase apoptosis ekstrak etanol daun sirih merah pada sel WiDr sebesar 89,47 ± 2,97 Tabel 1. Jumlah
apoptosis pada kelompok perlakuan terhitung besar walaupun dari hasil pengamatan terdapat sel WiDr yang masih hidup. Persentase ekstrak etanolik daun
sirih merah juga dibandingkan dengan persentase doksorubisin pada sel WiDr yaitu sebesar 92,92±2,97 Immanuel 2015. Persentase apoptosis dengan
perlakuan ekstrak terhitung lebih kecil dari doksorubisin karena doksorubisin merupakan agen kemoterapi yang telah terbukti dapat menginduksi apoptosis
Abdolmohammadi et al., 2008, sedangkan ekstrak daun sirih merah masih
A B
C
55
mengandung senyawa-senyawa yang dapat bekerja sinergis membentuk apoptosis atau bahkan menghambat apoptosis. Meskipun demikian, berdasarkan penelitian
ini dapat dikatakan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah dapat menginduksi apoptosis pada sel WiDr.
D. Uji Penekanan Ekspresi COX-2 oleh Ekstrak Etanol Daun Sirih
