METODE ISOLASI CAMPYLOBACTER JEJUNI

suhu rendah dapat memperlambat metabolisme mikroba pada sampel, sehingga sampel dapat disimpan pada waktu yang cukup lama dengan kondisi yang tetap baik. Sampel karkas ayam tersebut mampu bertahan sampai beberapa minggu, sebelum dilakukan analisis keberadaan C. jejuni di laboratorium.

B. METODE ISOLASI CAMPYLOBACTER JEJUNI

Pada penelitian ini digunakan dua metode dalam isolasi Campylobacter jejuni. yaitu metode modifikasi I BAM 2001 dan metode modifikasi II BAM 2001. Kedua metode ini merupakan modifikasi dari metode standar isolasi C. jejuni berdasarkan BAM tahun 2001. Perbedaan tahapan-tahapan kedua metode isolasi C. jejuni dengan metode standar isolasi C. jejuni dapat dilihat pada Tabel 6. Pada metode modifikasi I BAM 2001, dilakukan beberapa modifikasi terkait tahap persiapan sampel, dan tahapan plating. Menurut BAM 2001, pada tahap persiapan sampel, sampel karkas ayam dibilas menggunakan larutan BPW 0,1. Hal ini bertujuan sebagai tahapan pra pengkayaan terhadap sampel yang akan dianalisis keberadaan C. jejuni. Tabel 6. Perbedaan tahapan-tahapan kedua metode penelitian dengan metode standar isolasi C. jejuni BAM 2001 Metode Persiapan sampel Pengkayaan Sentrifuse Inkubasi Pengenceran Plating Pengamatan Modifikasi I BAM 2001 Pembilasan rinsing 150 gram sampel Enrichment dengan 50 ml Bolton Broth - 37 C selama 2 jam, dan 42 C selama 48 jam Tanpa pengenceran, Plating dengan teknik gores kuadran Katalase, mikroskop dengan pewarnaan sederhana Modifikasi II BAM 2001 Pembilasan rinsing 150 gram sampel Pre-Enrichment dengan 50 ml BPW 0.1 dan Enrichment dengan 20 ml Bolton Broth Kecepatan putaran 7.000 x g 3.500 rpm selama 20 menit 37 C selama 2 jam, dan 42 C selama 48 jam Tanpa pengenceran, Plating dengan teknik gores kuadran Katalase, mikroskop dengan pewarnaan sederhana BAM 2001 Pembilasan rinsing 25 gram sampel Pre-Enrichment dengan 200 ml BPW 0.1 dan Enrichment dengan 100 ml Bolton Broth Dilakukan filtrasi kemudian disentrifuse dengan kecepatan putaran 16.000 x g 8.000 rpm selama 15 menit 37 C selama 4 jam, dan 42 C selama 48 jam dengan shaking atau 52 jam tanpa shaking pengenceran 1:100 0.1 ml kedalam 9.9 ml 0.1 Pepton Water, Plating dengan teknik tuang Mikroskop dengan preparat basah, pewarnaan gram Namun, pada metode modifikasi I BAM 2001, larutan BPW 0,1 sebagai bahan pembilas digantikan dengan Bolton Broth, yang sebenarnya merupakan media pengkaya untuk pertumbuhan C. jejuni. Sehingga dapat dikatakan bahwa pada metode modifikasi I, tidak ada tahapan pra pengkayaan terhadap sampel yang akan dianalisis. Penggantian larutan pembilas BPW 0.1 dengan Bolton Broth didasarkan pada penelitian sebelumnya Abdi, 2007, yang menyatakan bahwa pembilasan dengan larutan BPW 0,1 atau langsung menggunakan Bolton Broth sebagai bahan pembilas sampel tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan terhadap hasil isolasi C. jejuni. Selain itu, pada persiapan sampel dengan metode modifikasi I juga tidak dilakukan proses sentrifuse terhadap cairan bekas pembilasan sampel. Hal ini dilakukan karena diduga bakteri C. jejuni berada dalam jumlah yang cukup banyak pada sampel karkas ayam, sehingga tidak perlu dilakukan proses sentrifuse untuk mengkonsentrasikan bakteri yang ada pada cairan bekas pembilasan sampel karkas ayam tersebut. Pada metode BAM 2001, sebelum plating, cairan hasil inkubasi diencerkan 1:100 0.1 ml kedalam 9.9 ml 0.1 Pepton Water. Setelah itu sebanyak 1 ml dipindahkan secara aseptis kedalam cawan petri dan dilakukan penuangan dengan media agar isolasi yang telah dipersiapkan. Setelah media agar mengeras, maka dilakukan inkubasi pada suhu 42 C selama 24 – 48 jam dibawah kondisi mikroaerofilik. Pada metode modifikasi I BAM 2001, tidak dilakukan pengenceran terhadap cairan hasil inkubasi. Cairan hasil inkubasi hanya dipindahkan 1-2 loop kedalam media agar isolasi dengan teknik gores kuadran. Tahapan lengkap dari metode modifikasi I BAM 2001 dimulai dengan tahap persiapan sampel, yaitu dengan melakukan proses pembilasan terhadap sampel karkas ayam sebanyak 150 gram dengan menggunakan 50 ml Bolton Broth. Proses pembilasan dilakukan selama 2 menit dengan cara rinsing digosok-gosok. Proses pembilasan bertujuan untuk mengambil bakteri patogen yang umumnya ada di permukaan sampel. Cairan bekas pembilasan sampel kemudian dimasukkan kedalam botol gelap steril dan ditambahkan darah lisis 5 serta suplemen preston. Penggunaan botol gelap bertujuan untuk mencegah kerusakan Bolton Broth akibat paparan cahaya yang berlebihan. Menurut Bridson 1998, Bolton Broth lebih tepat jika disimpan dan ditempatkan pada kondisi yang minim cahaya dan pada suhu 10-25 C. Botol gelap yang berisi cairan Bolton Broth bekas pembilasan sampel, darah lisis 5, dan suplemen preston kemudian dimasukkan kedalam jar anaerob dan dilakukan pengkondisian mikroaerofilik menggunakan alat anoxomat. Selanjutnya, jar anaerob beserta isinya diinkubasi awal pada suhu 37 C selama 2 jam, dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 42 C selama 48 jam. Setelah inkubasi selesai, cairan hasil inkubasi kemudian digoreskan dengan teknik gores kuadran kedalam media mCCDA dan CBPA yang telah dipersiapkan sebelumnya. Pada metode modifikasi II BAM 2001, terdapat beberapa modifikasi terkait jumlah larutan BPW 0.1 yang digunakan sebagai larutan pembilas sampel, kecepatan putaran saat sentrifuse, jumlah pelet yang disuspensikan pada Bolton Broth, dan tahapan plating serta inkubasinya. Pada metode modifikasi II BAM 2001, hanya digunakan 50 ml BPW 0.1 untuk membilas 150 gram sampel karkas ayam. Hal ini dilakukan terkait volume tabung sentrifuse yang hanya 50 ml. Kecepatan sentrifuse pada metode modifikasi II BAM 2001 hanya 7.000 x g 3.500 rpm, sedangkan pada metode BAM 2001 digunakan kecepatan 16.000 x g 8.000 rpm. Hal ini dikarenakan alat sentrifuse yang digunakan sudah lama, sehingga tidak mampu mencapai kecepatan 16.000 x g 8.000 rpm. Pada metode modifikasi II, pelet + supernatan hasil sentrifuse sebanyak 5 ml disuspensikan langsung kedalam Bolton Broth. Pada metode BAM 2001, pelet hasil sentrifuse disuspensikan terlebih dahulu kedalam BPW 0.1, baru kemudian sebanyak 3 ml dipindahkan kedalam Bolton Broth. Pada metode modifikasi II BAM 2001, tidak dilakukan pengenceran terhadap cairan hasil inkubasi. Cairan hasil inkubasi hanya dipindahkan 1-2 loop kedalam media agar isolasi dengan teknik gores kuadran. Tahapan lengkap metode modifikasi II BAM 2001, dimulai dengan tahap persiapan sampel, yaitu dengan melakukan proses pembilasan sampel sebanyak 150 gram menggunkan 50 ml larutan BPW 0,1. Larutan BPW 0,1 mengandung senyawa kalium hidrogen phosphat, yang berfungsi untuk menjaga pH sampel tetap netral, dan senyawa pepton yang berfungsi sebagai pengkaya untuk pertumbuhan C. jejuni. Sehingga, selain sebagai bahan pembilas, BPW 0,1 juga berfungsi sebagai tahap pra pengkayaan terhadap sampel yang akan dianalisis. Proses pembilasan dilakukan selama 2 menit dengan cara rinsing digosok-gosok Selanjutnya, cairan bekas pembilasan sampel dimasukkan kedalam tabung santrifuse 50 ml untuk dilakukan tahapan sentrifugasi. Tahapan ini dilakukan untuk mengkonsentrasikan bakteri pada cairan bekas pembilasan sampel. Sentrifugasi dilakukan selama 20 menit dengan kecepatan putaran 7.000 x g 3.500 rpm. Setelah tahapan ini selesai, didapatkan pelet yang banyak mengandung bakteri karena proses sentrifugasi telah menyebabkan hampir semua bakteri terkonsentrasikan didasar tabung sentrifuse berupa pelet. Selain itu, didapatkan supernatan yang merupakan cairan bekas pembilasan sampel yang rendah kandungan bakterinya. Cairan supernatan hasil sentrifuse kemudian dibuang sehingga hanya tersisa 10 ml. Sebanyak 5 ml supernatan + pelet lalu dimasukkan kedalam botol gelap berisi 20 ml Bolton Broth. Jika pada metode modifikasi I Bolton Broth digunakan sebagai bahan pembilas sampel, maka pada metode modifikasi II Bolton Broth digunakan sebagai media pengkaya untuk isolasi C. jejuni. Tahapan pengkayaan dilakukan untuk memperbesar peluang pertumbuhan C. jejuni yang ternyata sangat sensitif terhadap kehadiran bakteri lain. Media Bolton Broth mengandung senyawa Rifampicin yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri lain yang sering mengkontaminasi dalam proses isolasi C. jejuni Bolton dan Robertson, 1982. Selanjutnya, kedalam Bolton Broth ditambahkan darah lisis 5 1,25 ml, suplemen preston, dan FBP Growth Factor Supplement. Fungsi penambahan darah lisis, suplemen preston, dan FBP akan dibahas pada bagian lain. Setelah itu, dilakukan pengkondisian mikroaerofilik terhadap Bolton Broth yang telah ditambahkan darah lisis, suplemen preston, dan FBP menggunakan alat anoxomat. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C selama 2 jam dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 42 C selama 48 jam. Setelah inkubasi selesai, kemudian dilakukan gores kuadran kedalam media mCCDA dan CBPA yang telah dipersiapkan sebelumnya. Teknik gores kuadran bertujuan untuk mendapatkan koloni C. jejuni yang terpisah., sehingga memberi kemudahan saat proses identifikasi Campylobacter. Hasil isolasi C. jejuni dengan menggunakan metode modifikasi I dan metode modifikasi II BAM 2001 dapat dilihat pada Tabel 7. Tabel 7. Hasil isolasi C. jejuni dengan menggunakan beberapa metode Metode Isolasi Jumlah Sampel Jumlah sampel yang tercemar C. jejuni Persentase Modifikasi I BAM 2001 48 14 29.2 Modifikasi II BAM 2001 36 16 44.4 Abdi I 40 9 22.5 Abdi II 30 2 6.7 Sumber : Abdi 2007 Berdasarkan Tabel 7, diketahui bahwa dari 48 sampel karkas ayam yang dianalisis menggunakan metode modifikasi I, ada 14 sampel 29.2 yang teridentifikasi positif C. jejuni. Sedangkan dari 36 sampel karkas ayam yang dianalisis menggunakan metode modifikasi II, ada 16 sampel 44.4 yang teridentifikasi positif C. jejuni. Berdasarkan Tabel 7, dapat diketahui juga bahwa ada dua metode lain yang dapat digunakan untuk isolasi C. jejuni dari sampel karkas ayam. Kedua metode itu merupakan metode yang dipakai pada penelitian sebelumnya Abdi, 2007. Ada beberapa tahapan yang berbeda antara dua metode ini dengan dua metode isolasi C. jejuni yang digunakan pada penelitian ini. Sebagai bahan perbandingan, maka tahapan-tahapan dalam metode isolasi C. jejuni pada penelitian sebelumnya dapat dilihat pada Tabel 8. Metode Abdi I merupakan metode isolasi C. jejuni yang pertama kali dilakukan oleh peneliti. Hal ini didasarkan pada literatur yang menjelaskan, bahwa C. jejuni ditemukan lebih dari 10 3 CFUg atau 3 Log CFUg pada karkas ayam Altekrus et al., 1999, sehingga metode pertama awalnya digunakan untuk analisis Campylobacter secara kuantitatif dengan metode penyebaran spread plate pada media selektif. Namun pada penelitian ini digunakan untuk uji kualitatif, dengan mengamati tumbuhnya koloni spesifik pada media agar selektif Campylobacter. Tabel 8. Tahapan-tahapan dari dua metode isolasi C. jejuni penelitian sebelumnya Abdi, 2007 Pada metode Abdi II, yang merupakan metode modifikasi Poeloengan dan Noor, tahapan-tahapan yang dilakukan terdiri dari tahap persiapan sampel dengan metode pembilasan, tahap pengkayaan, inkubasi pada 42 o C, dan pengamatan di bawah mikroskop. Tahapan-tahapan isolasi C. jejuni pada metode ini dilakukan dengan harapan bahwa metode ini merupakan metode yang dapat meyempurnakan metode pertama dalam meningkatkan efektivitas isolasi C. jejuni. Persiapan sampel pada metode Abdi I yaitu metode penghancuran dengan menggunakan stomacher. Sampel diambil secara acak sehingga jumlah yang dianalisis akan terwakili dari seluruh bagian karkas ayam. Sedangkan pada metode Abdi II, persiapan sampel dengan pembilasan dilakukan dengan asumsi bahwa bakteri patogen tidak tersebar merata pada sampel tetapi hanya mengkontaminasi bagian permukaan sampel. Pada metode Abdi I tidak dilakukan pengkayaan pada sampel, karena diduga C. jejuni terdapat banyak pada sampel. Sedangkan, tahap pengkayaan pada metode Abdi II dilakukan dengan alasan bahwa C. jejuni tidak tumbuh di bawah 30 o C serta sensitif pada konsentrasi O 2 normal 21 O 2 , sehingga hanya sejumlah kecil bakteri ini yang mungkin ditemukan pada karkas ayam. Oleh karena itu, dibutuhkan media pengkayaan untuk memperbanyak sel C. Metode Persiapan sampel Tahapan Pengkayaan Sentrifuse Inkubasi Pengamatan Abdi I Penghancuran Tidak ada Tidak ada 37 C TSIA, Katalase, mikroskop Abdi II Pembilasan Pre- Enrichment dan Enrichment Tidak ada 42 C Mikroskop jejuni yang ada pada sampel tersebut. Tahap pengkayaan yang dilakukan meliputi tahap pre-enrichment dan enrichment. Tahap pre-enrichment menggunakan media BPW 0.1, sedangkan tahap enrichment menggunakan media BBPB Bolton-Blood-Preston-Broth. Suhu pertumbuhan yang baik bagi spesies Campylobacter termofilik seperti C. jejuni, C. coli, dan C. lari yaitu antara 37 o C sampai 42 o C McClure dan Blackburn, 2003. Pada metode Abdi I, suhu inkubasi yang digunakan dalam isolasi C. jejuni adalah 37 o C, maka pada metode Abdi II suhu inkubasi ditingkatkan menjadi 42 o C. Menurut Stern et al. 1992, suhu optimum pertumbuhan C. jejuni yaitu 42 o C. Pengamatan C. jejuni pada metode Abdi I yaitu dilakukan dengan memilih koloni-koloni tipikal yang tumbuh pada media CBPA Columbia- Blood-Preston-Agar, yang dilanjutkan dengan pengamatan di bawah mikroskop, penggoresan koloni pada media TSIA, dan uji katalase. Pada metode Abdi II, pengamatan C. jejuni hanya dengan pengamatan di bawah mikroskop. Hal ini dikarenakan isolat yang telah ditemukan selanjutnya akan diidentifikasi dengan API-Campy test kit. Pada metode Abdi I, sampel yang dianalisis C. jejuni-nya berasal dari pasar tradisional di Bogor. Dengan anggapan bahwa sebagian besar masyarakat Bogor masih memanfaatkan pasar tradisional sebagai tempat pembelian kebutuhan bahan pangan. Sedangkan, sampel yang dianalisis dengan metode Abdi II berjumlah 30, yaitu sebanyak 15 sampel berasal dari pasar tradisional dan sisanya berasal dari supermarket. Pengambilan sampel yang berasal dari pasar tradisional dan supermarket bertujuan untuk mengetahui tingkat kontaminasi C. jejuni pada sampel dari kedua tempat tersebut. Hal ini berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan oleh Poeloengan dan Noor 2003, bahwa tingkat kontaminasi C. jejuni pada daging ayam yang berasal dari pasar tradisional lebih rendah jika dibandingkan dengan daging ayam yang berasal dari supermarket. Untuk pembahasan lebih lengkap tentang kedua metode ini dapat dilihat pada hasil penelitian sebelumnya Abdi, 2007 Berdasarkan Tabel 7, dapat diketahui bahwa persentase isolasi C. jejuni pada sampel karkas ayam dengan metode modifikasi I BAM 2001 yaitu sebesar 29.2, metode modifikasi II BAM 2001 sebesar 44.4, metode Abdi I pada penelitian sebelumnya Abdi, 2007 sebesar 22.5, sedangkan dengan menggunakan metode Abdi II yaitu sebesar 6.7. Dari hasil ini diketahui bahwa tingkat persentase isolasi C. jejuni dengan metode modifikasi I BAM 2001, metode Abdi I, dan metode Abdi II lebih kecil dibandingkan dengan metode modifikasi II BAM 2001.

C. MEDIA SELEKTIF DALAM ISOLASI CAMPYLOBACTER JEJUNI