suhu rendah dapat memperlambat metabolisme mikroba pada sampel, sehingga sampel dapat disimpan pada waktu yang cukup lama dengan kondisi
yang tetap baik. Sampel karkas ayam tersebut mampu bertahan sampai beberapa minggu, sebelum dilakukan analisis keberadaan C. jejuni di
laboratorium.
B. METODE ISOLASI CAMPYLOBACTER JEJUNI
Pada penelitian
ini digunakan
dua metode
dalam isolasi
Campylobacter jejuni. yaitu metode modifikasi I BAM 2001 dan metode modifikasi II BAM 2001. Kedua metode ini merupakan modifikasi dari
metode standar isolasi C. jejuni berdasarkan BAM tahun 2001. Perbedaan tahapan-tahapan kedua metode isolasi C. jejuni dengan metode standar isolasi
C. jejuni dapat dilihat pada Tabel 6. Pada metode modifikasi I BAM 2001, dilakukan beberapa modifikasi
terkait tahap persiapan sampel, dan tahapan plating. Menurut BAM 2001, pada tahap persiapan sampel, sampel karkas ayam dibilas menggunakan
larutan BPW 0,1. Hal ini bertujuan sebagai tahapan pra pengkayaan terhadap sampel yang akan dianalisis keberadaan C. jejuni.
Tabel 6. Perbedaan tahapan-tahapan kedua metode penelitian dengan metode standar isolasi C. jejuni BAM 2001
Metode Persiapan
sampel Pengkayaan
Sentrifuse Inkubasi
Pengenceran Plating
Pengamatan Modifikasi I
BAM 2001 Pembilasan
rinsing 150 gram sampel
Enrichment dengan 50 ml
Bolton Broth -
37 C selama 2
jam, dan 42 C
selama 48 jam Tanpa pengenceran,
Plating dengan teknik gores
kuadran Katalase,
mikroskop dengan pewarnaan
sederhana
Modifikasi II BAM 2001
Pembilasan rinsing 150
gram sampel Pre-Enrichment
dengan 50 ml BPW 0.1 dan
Enrichment dengan 20 ml
Bolton Broth Kecepatan putaran
7.000 x g 3.500 rpm selama 20
menit 37
C selama 2 jam, dan 42
C selama 48 jam
Tanpa pengenceran, Plating dengan
teknik gores kuadran
Katalase, mikroskop dengan
pewarnaan sederhana
BAM 2001 Pembilasan
rinsing 25 gram sampel
Pre-Enrichment dengan 200 ml
BPW 0.1 dan Enrichment
dengan 100 ml Bolton Broth
Dilakukan filtrasi kemudian
disentrifuse dengan kecepatan putaran
16.000 x g 8.000 rpm selama 15
menit 37
C selama 4 jam, dan 42
C selama 48 jam
dengan shaking atau 52 jam
tanpa shaking pengenceran 1:100
0.1 ml kedalam 9.9 ml 0.1 Pepton
Water, Plating dengan teknik
tuang Mikroskop dengan
preparat basah, pewarnaan gram
Namun, pada metode modifikasi I BAM 2001, larutan BPW 0,1 sebagai bahan pembilas digantikan dengan Bolton Broth, yang sebenarnya
merupakan media pengkaya untuk pertumbuhan C. jejuni. Sehingga dapat dikatakan bahwa pada metode modifikasi I, tidak ada tahapan pra pengkayaan
terhadap sampel yang akan dianalisis. Penggantian larutan pembilas BPW 0.1 dengan Bolton Broth didasarkan pada penelitian sebelumnya Abdi, 2007,
yang menyatakan bahwa pembilasan dengan larutan BPW 0,1 atau langsung menggunakan Bolton Broth sebagai bahan pembilas sampel tidak
menunjukkan perbedaan yang signifikan terhadap hasil isolasi C. jejuni. Selain itu, pada persiapan sampel dengan metode modifikasi I juga
tidak dilakukan proses sentrifuse terhadap cairan bekas pembilasan sampel. Hal ini dilakukan karena diduga bakteri C. jejuni berada dalam jumlah yang
cukup banyak pada sampel karkas ayam, sehingga tidak perlu dilakukan proses sentrifuse untuk mengkonsentrasikan bakteri yang ada pada cairan
bekas pembilasan sampel karkas ayam tersebut. Pada metode BAM 2001, sebelum plating, cairan hasil inkubasi
diencerkan 1:100 0.1 ml kedalam 9.9 ml 0.1 Pepton Water. Setelah itu sebanyak 1 ml dipindahkan secara aseptis kedalam cawan petri dan dilakukan
penuangan dengan media agar isolasi yang telah dipersiapkan. Setelah media agar mengeras, maka dilakukan inkubasi pada suhu 42
C selama 24 – 48 jam
dibawah kondisi mikroaerofilik. Pada metode modifikasi I BAM 2001, tidak dilakukan pengenceran terhadap cairan hasil inkubasi. Cairan hasil inkubasi
hanya dipindahkan 1-2 loop kedalam media agar isolasi dengan teknik gores kuadran.
Tahapan lengkap dari metode modifikasi I BAM 2001 dimulai dengan tahap persiapan sampel, yaitu dengan melakukan proses pembilasan terhadap
sampel karkas ayam sebanyak 150 gram dengan menggunakan 50 ml Bolton Broth. Proses pembilasan dilakukan selama 2 menit dengan cara rinsing
digosok-gosok. Proses pembilasan bertujuan untuk mengambil bakteri patogen yang umumnya ada di permukaan sampel. Cairan bekas pembilasan
sampel kemudian dimasukkan kedalam botol gelap steril dan ditambahkan darah lisis 5 serta suplemen preston. Penggunaan botol gelap bertujuan
untuk mencegah kerusakan Bolton Broth akibat paparan cahaya yang berlebihan. Menurut Bridson 1998, Bolton Broth lebih tepat jika disimpan
dan ditempatkan pada kondisi yang minim cahaya dan pada suhu 10-25 C.
Botol gelap yang berisi cairan Bolton Broth bekas pembilasan sampel, darah lisis 5, dan suplemen preston kemudian dimasukkan kedalam jar anaerob
dan dilakukan pengkondisian mikroaerofilik menggunakan alat anoxomat. Selanjutnya, jar anaerob beserta isinya diinkubasi awal pada suhu 37
C selama 2 jam, dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 42
C selama 48 jam. Setelah inkubasi selesai, cairan hasil inkubasi kemudian digoreskan
dengan teknik gores kuadran kedalam media mCCDA dan CBPA yang telah dipersiapkan sebelumnya.
Pada metode modifikasi II BAM 2001, terdapat beberapa modifikasi terkait jumlah larutan BPW 0.1 yang digunakan sebagai larutan pembilas
sampel, kecepatan putaran saat sentrifuse, jumlah pelet yang disuspensikan pada Bolton Broth, dan tahapan plating serta inkubasinya. Pada metode
modifikasi II BAM 2001, hanya digunakan 50 ml BPW 0.1 untuk membilas 150 gram sampel karkas ayam. Hal ini dilakukan terkait volume tabung
sentrifuse yang hanya 50 ml. Kecepatan sentrifuse pada metode modifikasi II BAM 2001 hanya 7.000 x g 3.500 rpm, sedangkan pada metode BAM 2001
digunakan kecepatan 16.000 x g 8.000 rpm. Hal ini dikarenakan alat sentrifuse yang digunakan sudah lama, sehingga tidak mampu mencapai
kecepatan 16.000 x g 8.000 rpm. Pada metode modifikasi II, pelet + supernatan hasil sentrifuse sebanyak 5 ml disuspensikan langsung kedalam
Bolton Broth. Pada metode BAM 2001, pelet hasil sentrifuse disuspensikan terlebih dahulu kedalam BPW 0.1, baru kemudian sebanyak 3 ml
dipindahkan kedalam Bolton Broth. Pada metode modifikasi II BAM 2001, tidak dilakukan pengenceran terhadap cairan hasil inkubasi. Cairan hasil
inkubasi hanya dipindahkan 1-2 loop kedalam media agar isolasi dengan teknik gores kuadran.
Tahapan lengkap metode modifikasi II BAM 2001, dimulai dengan tahap persiapan sampel, yaitu dengan melakukan proses pembilasan sampel
sebanyak 150 gram menggunkan 50 ml larutan BPW 0,1. Larutan BPW
0,1 mengandung senyawa kalium hidrogen phosphat, yang berfungsi untuk menjaga pH sampel tetap netral, dan senyawa pepton yang berfungsi sebagai
pengkaya untuk pertumbuhan C. jejuni. Sehingga, selain sebagai bahan pembilas, BPW 0,1 juga berfungsi sebagai tahap pra pengkayaan terhadap
sampel yang akan dianalisis. Proses pembilasan dilakukan selama 2 menit dengan cara rinsing digosok-gosok
Selanjutnya, cairan bekas pembilasan sampel dimasukkan kedalam tabung santrifuse 50 ml untuk dilakukan tahapan sentrifugasi. Tahapan ini
dilakukan untuk mengkonsentrasikan bakteri pada cairan bekas pembilasan sampel. Sentrifugasi dilakukan selama 20 menit dengan kecepatan putaran
7.000 x g 3.500 rpm. Setelah tahapan ini selesai, didapatkan pelet yang banyak mengandung bakteri karena proses sentrifugasi telah menyebabkan
hampir semua bakteri terkonsentrasikan didasar tabung sentrifuse berupa pelet. Selain itu, didapatkan supernatan yang merupakan cairan bekas
pembilasan sampel yang rendah kandungan bakterinya. Cairan supernatan hasil sentrifuse kemudian dibuang sehingga hanya
tersisa 10 ml. Sebanyak 5 ml supernatan + pelet lalu dimasukkan kedalam botol gelap berisi 20 ml Bolton Broth. Jika pada metode modifikasi I Bolton
Broth digunakan sebagai bahan pembilas sampel, maka pada metode modifikasi II Bolton Broth digunakan sebagai media pengkaya untuk isolasi
C. jejuni. Tahapan pengkayaan dilakukan untuk memperbesar peluang pertumbuhan C. jejuni yang ternyata sangat sensitif terhadap kehadiran bakteri
lain. Media Bolton Broth mengandung senyawa Rifampicin yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri lain yang sering mengkontaminasi dalam
proses isolasi C. jejuni Bolton dan Robertson, 1982. Selanjutnya, kedalam Bolton Broth ditambahkan darah lisis 5 1,25
ml, suplemen preston, dan FBP Growth Factor Supplement. Fungsi penambahan darah lisis, suplemen preston, dan FBP akan dibahas pada bagian
lain. Setelah itu, dilakukan pengkondisian mikroaerofilik terhadap Bolton Broth yang telah ditambahkan darah lisis, suplemen preston, dan FBP
menggunakan alat anoxomat. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C selama 2
jam dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 42 C selama 48 jam. Setelah
inkubasi selesai, kemudian dilakukan gores kuadran kedalam media mCCDA dan CBPA yang telah dipersiapkan sebelumnya. Teknik gores kuadran
bertujuan untuk mendapatkan koloni C. jejuni yang terpisah., sehingga memberi kemudahan saat proses identifikasi Campylobacter. Hasil isolasi C.
jejuni dengan menggunakan metode modifikasi I dan metode modifikasi II BAM 2001 dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7. Hasil isolasi C. jejuni dengan menggunakan beberapa metode
Metode Isolasi Jumlah
Sampel Jumlah sampel
yang tercemar C. jejuni
Persentase Modifikasi I BAM 2001
48 14
29.2 Modifikasi II BAM 2001
36 16
44.4 Abdi I
40 9
22.5 Abdi II
30 2
6.7 Sumber : Abdi 2007
Berdasarkan Tabel 7, diketahui bahwa dari 48 sampel karkas ayam yang dianalisis menggunakan metode modifikasi I, ada 14 sampel 29.2
yang teridentifikasi positif C. jejuni. Sedangkan dari 36 sampel karkas ayam yang dianalisis menggunakan metode modifikasi II, ada 16 sampel 44.4
yang teridentifikasi positif C. jejuni. Berdasarkan Tabel 7, dapat diketahui juga bahwa ada dua metode lain
yang dapat digunakan untuk isolasi C. jejuni dari sampel karkas ayam. Kedua metode itu merupakan metode yang dipakai pada penelitian sebelumnya
Abdi, 2007. Ada beberapa tahapan yang berbeda antara dua metode ini dengan dua metode isolasi C. jejuni yang digunakan pada penelitian ini.
Sebagai bahan perbandingan, maka tahapan-tahapan dalam metode isolasi C. jejuni pada penelitian sebelumnya dapat dilihat pada Tabel 8.
Metode Abdi I merupakan metode isolasi C. jejuni yang pertama kali dilakukan oleh peneliti. Hal ini didasarkan pada literatur yang menjelaskan,
bahwa C. jejuni ditemukan lebih dari 10
3
CFUg atau 3 Log CFUg pada karkas ayam Altekrus et al., 1999, sehingga metode pertama awalnya
digunakan untuk analisis Campylobacter secara kuantitatif dengan metode
penyebaran spread plate pada media selektif. Namun pada penelitian ini digunakan untuk uji kualitatif, dengan mengamati tumbuhnya koloni spesifik
pada media agar selektif Campylobacter.
Tabel 8. Tahapan-tahapan dari dua metode isolasi C. jejuni penelitian
sebelumnya Abdi, 2007
Pada metode Abdi II, yang merupakan metode modifikasi Poeloengan dan Noor, tahapan-tahapan yang dilakukan terdiri dari tahap persiapan sampel
dengan metode pembilasan, tahap pengkayaan, inkubasi pada 42
o
C, dan pengamatan di bawah mikroskop. Tahapan-tahapan isolasi C. jejuni pada
metode ini dilakukan dengan harapan bahwa metode ini merupakan metode yang dapat meyempurnakan metode pertama dalam meningkatkan efektivitas
isolasi C. jejuni. Persiapan sampel pada metode Abdi I yaitu metode penghancuran
dengan menggunakan stomacher. Sampel diambil secara acak sehingga jumlah yang dianalisis akan terwakili dari seluruh bagian karkas ayam.
Sedangkan pada metode Abdi II, persiapan sampel dengan pembilasan dilakukan dengan asumsi bahwa bakteri patogen tidak tersebar merata pada
sampel tetapi hanya mengkontaminasi bagian permukaan sampel. Pada metode Abdi I tidak dilakukan pengkayaan pada sampel, karena
diduga C. jejuni terdapat banyak pada sampel. Sedangkan, tahap pengkayaan pada metode Abdi II dilakukan dengan alasan bahwa C. jejuni tidak tumbuh
di bawah 30
o
C serta sensitif pada konsentrasi O
2
normal 21 O
2
, sehingga hanya sejumlah kecil bakteri ini yang mungkin ditemukan pada karkas ayam.
Oleh karena itu, dibutuhkan media pengkayaan untuk memperbanyak sel C. Metode
Persiapan sampel
Tahapan Pengkayaan Sentrifuse Inkubasi Pengamatan
Abdi I Penghancuran
Tidak ada Tidak ada
37 C
TSIA, Katalase,
mikroskop Abdi II
Pembilasan Pre-
Enrichment dan
Enrichment Tidak ada
42 C
Mikroskop
jejuni yang ada pada sampel tersebut. Tahap pengkayaan yang dilakukan meliputi tahap pre-enrichment dan enrichment. Tahap pre-enrichment
menggunakan media BPW 0.1, sedangkan tahap enrichment menggunakan media BBPB Bolton-Blood-Preston-Broth.
Suhu pertumbuhan yang baik bagi spesies Campylobacter termofilik seperti C. jejuni, C. coli, dan C. lari yaitu antara 37
o
C sampai 42
o
C McClure dan Blackburn, 2003. Pada metode Abdi I, suhu inkubasi yang digunakan
dalam isolasi C. jejuni adalah 37
o
C, maka pada metode Abdi II suhu inkubasi ditingkatkan menjadi 42
o
C. Menurut Stern et al. 1992, suhu optimum pertumbuhan C. jejuni yaitu 42
o
C. Pengamatan C. jejuni pada metode Abdi I yaitu dilakukan dengan
memilih koloni-koloni tipikal yang tumbuh pada media CBPA Columbia- Blood-Preston-Agar, yang dilanjutkan dengan pengamatan di bawah
mikroskop, penggoresan koloni pada media TSIA, dan uji katalase. Pada metode Abdi II, pengamatan C. jejuni hanya dengan pengamatan di bawah
mikroskop. Hal ini dikarenakan isolat yang telah ditemukan selanjutnya akan diidentifikasi dengan API-Campy test kit.
Pada metode Abdi I, sampel yang dianalisis C. jejuni-nya berasal dari pasar tradisional di Bogor. Dengan anggapan bahwa sebagian besar
masyarakat Bogor masih memanfaatkan pasar tradisional sebagai tempat pembelian kebutuhan bahan pangan. Sedangkan, sampel yang dianalisis
dengan metode Abdi II berjumlah 30, yaitu sebanyak 15 sampel berasal dari pasar tradisional dan sisanya berasal dari supermarket. Pengambilan sampel
yang berasal dari pasar tradisional dan supermarket bertujuan untuk mengetahui tingkat kontaminasi C. jejuni pada sampel dari kedua tempat
tersebut. Hal ini berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan oleh Poeloengan dan Noor 2003, bahwa tingkat kontaminasi C. jejuni pada daging ayam yang
berasal dari pasar tradisional lebih rendah jika dibandingkan dengan daging ayam yang berasal dari supermarket. Untuk pembahasan lebih lengkap tentang
kedua metode ini dapat dilihat pada hasil penelitian sebelumnya Abdi, 2007 Berdasarkan Tabel 7, dapat diketahui bahwa persentase isolasi C.
jejuni pada sampel karkas ayam dengan metode modifikasi I BAM 2001 yaitu
sebesar 29.2, metode modifikasi II BAM 2001 sebesar 44.4, metode Abdi I pada penelitian sebelumnya Abdi, 2007 sebesar 22.5, sedangkan dengan
menggunakan metode Abdi II yaitu sebesar 6.7. Dari hasil ini diketahui bahwa tingkat persentase isolasi C. jejuni dengan metode modifikasi I BAM
2001, metode Abdi I, dan metode Abdi II lebih kecil dibandingkan dengan metode modifikasi II BAM 2001.
C. MEDIA SELEKTIF DALAM ISOLASI CAMPYLOBACTER JEJUNI