Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens dan Staphylococcus aureus Dreesen, 1998. Prevalensi dari enam bakteri patogen tersebut pada karkas
dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 . Prevalensi dari 6 bakteri patogen terhadap manusia berasal dari
karkas ayam ICGFI, 1999
Bakteri Patogen Prevalensi
Campylobacter sp. 0-100
Clostridium perfringens 63
Escherichia coli O157:H7 1,5
Salmonella sp. 0-100
Staphylococcus aureus 88
Listeria monocytogenes 5
Menurut Poeloengan dan Noor 2003, C. jejuni mengkontaminasi karkas ayam bagian punggung hingga tunggir lebih tinggi jika dibandingkan
dengan bagian dada, paha, dan hati-ampela ayam. Hal ini terjadi kemungkinan karena pada waktu memproses ayam mulai dari pengulitan bulu sampai
eviserasi pengeluaran organ sangat mudah sekali terjadi kontaminasi dari saluran pencernaan.
E. METODE ISOLASI CAMPYLOBACTER
Banyak metode
yang dapat
digunakan untuk
mengisolasi Campylobacter jejuni dari sampel. Metode-metode ini dirancang dengan
memperhatikan kondisi dan prasyarat tumbuhnya Campylobacter. Hal ini dikarenakan bakteri ini sulit untuk diisolasi berkaitan dengan sifatnya yang
dapat menjadi sel yang Viable but Non Culturable. Beberapa metode isolasi C. jejuni diantaranya metode isolasi awal yang dikembangkan oleh Skirrow,
metode isolasi yang dikembangkan oleh Doyle, metode standar isolasi C. jejuni yang dikeluarkan oleh BAM tahun 2001, sampai metode paling
mutakhir menggunakan uji berdasarkan DNA homolog dan penggunaan Polymerase Chain reaction PCR McClure dan Blackburn, 2003. Metode
– metode yang ada merupakan hasil pengembangan dan modifikasi metode
sebelumnya untuk tujuan tertentu serta disesuaikan dengan jenis sampel yang
akan dianalisis. Perbedaan antara metode-metode tersebut terletak pada perbedaan kondisi suhu dan komposisi udara saat inkubasi. Selain itu juga
terletak pada perbedaan media pengkaya dan media agar selektif yang digunakan dalam isolasi.
Sampel yang akan diisolasi Campylobacter harus dikondisikan pada suhu rendah dan kondisi vakum agar keberadaan Campylobacter pada sampel
tidak mengalami perubahan. Untuk mengkondisikan suhu rendah sampel dapat dimasukkan kedalam coolbox. Sampel didalam coolbox harus dianalisa
dan diisolasi Campylobacter jejuni kurang dari 4 jam setelah sampel tersebut diambil. Jika sampel dikondisikan vakum terlebih dahulu dan kemudian
disimpan pada suhu freezer, maka analisa dan isolasi Campylobacter jejuni dapat dilakukan pada hari yang berbeda.
Pada metode standar isolasi C. jejuni berdasarkan BAM 2001, proses isolasi C. jejuni dimulai dengan persiapan sampel. Sebenarnya, ada dua
metode dalam persiapan sampel. Metode yang pertama adalah metode swab usap. Metode ini banyak digunakan untuk isolasi bakteri Campylobacter
pada sampel berupa daging hewan kebanyakan yang mempunyai luas permukaan yang lebar. Pada metode ini daging yang telah disiapkan di-swab
atau diusap menggunakan batang pengusap steril, kemudian batang pengusap ini dimasukkan kedalam larutan buffer steril atau sejenisnya dan dicuci.
Larutan hasil pencucian inilah yang kemudian digunakan untuk tahap selanjutnya pada isolasi Campylobacter
Pada BAM 2001, digunakan metode yang kedua yaitu metode rinsing, metode ini banyak digunakan untuk menyiapkan sampel berupa
karkas ayam pada isolasi Campylobacter. Pada metode ini, sampel sebanyak 25 gram atau disesuaikan dengan kondisi sampel dimasukkan kedalam plastik
steril, kemudian kedalam plastik steril ditambahkan 200 ml 0.1 Pepton Water BPW. Setelah itu dilakukan proses pembilasan terhadap sampel
selama 2 - 3 menit dengan cara rinsing digosok-gosok. Selanjutnya, cairan bekas pembilasan sampel difiltrasi disaring menggunakan kain saring steril
dan dimasukkan kedalam tabung sentrifuse 250 ml untuk dilakukan proses sentrifuse. Sentrifuse dilakukan selama 15 menit dengan kecepatan putaran
16.000 x g 8.000 rpm. Setelah proses sentrifuse selesai, supernatannya dibuang, sedangkan peletnya disuspensikan kedalam 10 ml 0.1 Pepton
Water BPW. Sebanyak 3ml campuran pelet kemudian dimasukkan kedalam 100 ml Bolton Broth.
Selanjutnya, dilakukan isolasi C. jejuni yang dimulai dengan menambahkan 5 darah kuda lisis, dan suplemen antibiotik kedalam Bolton
Broth. Dapat juga ditambahkan FBP Supplement Growth Factor untuk meningkatkan sifat aerotoleran Campylobacter. Setelah itu, dilakukan
inkubasi pada suhu 37 C selama 4 jam dibawah kondisi mikroaerofilik dan ini
merupakan tahapan pra-pengkayaan. Setelah inkubasi selesai, inkubasi dilanjutkan dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi 42
C dan ini merupakan tahapan pengkayaan. Jika selama inkubasi dilakukan shaking pada
media Broth, maka inkubasi dilakukan selama 23 – 24 jam. Jika tanpa
shaking, inkubasi dilakukan selama 28 – 29 jam. Untuk beberapa jenis
Campylobacter inkubasi dilakukan pada suhu 42 C selama 48 jam dengan
shaking pada media atau selama 52 jam jika tanpa shaking. Setelah inkubasi selama 24
– 48 jam, dilakukan pengenceran 1:100 0.1 ml kedalam 9.9 ml 0.1 Pepton Water. Kemudian sebanyak 1 ml
dipindahkan secara aseptis kedalam cawan petri dan dilakukan penuangan dengan media agar isolasi yang telah dipersiapkan. Setelah media agar
mengeras, maka dilakukan inkubasi pada suhu 42 C selama 24
– 48 jam dibawah kondisi mikroaerofilik. Setelah inkubasi selesai dapat dilakukan
pengamatan dan pengawetan kultur terhadap koloni C. jejuni yang tumbuh. Diagram alir metode isolasi C. jejuni berdasarkan BAM 2001 dapat dilihat
pada Gambar 1.
Sampel 25 gr karkas ayam
Dimasukkan dalam plastik steril berisi 200 ml BPW 0.1, rinsing selama 2-3 menit
Disentrifuse dengan kecepatan 16.000 x g 8.000 rpm selama 15 menit
Filtrat dimasukkan kedalam 250 ml tabung sentrifuse
Cairan supernatan Pelet
Diinkubasi pada 37
o
C selama 2-3 jam dalam kondisi mikroaerofilik
Diinkubasi kembali pada 42
o
C selama 48 jam dengan shaking dalam kondisi mikroaerofilik
Inkubasi pada 42
o
C selama 48 jam dalam kondisi mikroaerofilik Dilakukan pengenceran 1:100 0.1 ml kedalam 9.9 ml 0.1 Pepton Water,
1 ml dipindahkan ke cawan petri steril dan dituang dengan media selektif Cairan pencuci karkas disaring
dengan kain saring steril
Disuspensikan kedalam 10 ml larutan BPW 0.1
3 ml campuran pelet dimasukkan kedalam 100 ml Bolton Broth, dan ditambahkan 5 darah kuda lisis dan suplemen preston
Gambar 1. Diagram Alir Metode Isolasi C. jejuni Berdasarkan BAM 2001
Pada metode BAM 2001, analis atau peneliti dapat memilih satu dari tiga metode untuk memberikan kondisi mikroaerofilik pada media. Ketiga
metode itu yaitu menggelembungkan campuran gas kedalam media, penggoyangan shaking media agar udara dapat masuk, atau inkubasi pada jar
anaerob dengan atmosfir termodifikasi. Metode yang pertama dapat dilakukan dengan menggunakan sistem penggelembungan the bubbler system. Media
Broth yang akan dikondisikan mikroaerofilik dimasukkan kedalam plastik rangkap dua. Tujuannya untuk mencegah kebocoran media akibat plastik
robek saat proses penggoyangan shaking Kemudian pada bagian luar plastik ditambahkan 10 ml air dengan tujuan untuk mengoptimalkan pindah panas ke
media Broth. Setelah itu, plastik diletakkan kedalam keranjang stainless steel 4-6 plastikkeranjang dengan memberikan ruang udara pada keranjang.
Kemudian letakkan tip pipet 1 ml kedalam plastik dan ikat dengan kuat. Tip pipet ini terletak pada tabung yang terhubung dengan kran penggelembung
bubbler. Kran tabung gas kemudian dibuka dan diatur pada tekanan 4-6 lb dengan memutar ulir pengatur tekanan. Kondisi ini menyebabkan media
didalam kantong plastik dialiri gelembung dengan kecepatan 2-3 gelembung per detik. The bubbler system dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. The bubbler system BAM, 2001
Pada metode kedua dengan penggoyangan media Broth, media yang akan dikondisikan mikroaerofilik dimasukkan kedalam plastik, kemudian
plastik tersebut diseal menggunakan panas. Salah satu bagian sudut plastik kemudian dipotong dan udara didalam plastik dikeluarkan dengan cara
menekan plastik perlahan. Setelah itu, pipet dimasukkan kedalam plastik melalui sudut plastik yang berlubang, dan kran gas dibuka. Ruang diatas
media Broth dialiri gas, dan setiap periode tertentu udara didalam plastik dikeluarkan. Proses ini diakhiri dengan pemberian gas pada plastik, kemudian
dengan cepat plastik diseal dengan panas. Setelah itu, plastik dimasukkan kedalam keranjang, dan keranjang dipindahkan kedalam inkubator goyang
shaker incubator dengan kecepatan 175-200 rpm. Metode ketiga untuk mengkondisikan mikroaerofilik pada media
Broth dilakukan dengan sistem jar yang diberi gas. Menurut BAM 2001, media Broth yang akan dikondisikan mikroaerofilik ditempatkan pada
plastik dengan jumlah Broth setiap plastik tidak boleh lebih dari 125 ml. Kemudian plastik dimasukkan kedalam jar. Jar kemudian dihubungkan
dengan kran gas dari tabung melalui pipa. Setelah itu, jar dikondisikan vakum terlebih dahulu, baru diisi ulang dengan campuran gas sesuai kondisi
mikroaerofilik. Tekanan pada jar setelah kondisi mikroaerofilik tercapai adalah sebesar 5-10 lb. Keunggulan metode ketiga ini adalah media Broth
juga dapat ditempatkan pada labu erlenmeyer, tidak harus pada plastik seperti pada metode pertama dan kedua dalam pengkondisian mikroaerofilik.
Pada metode ketiga, pengkondisian mikroaerofilik dalam jar dapat dibantu dengan alat anoxomat. Anoxomat merupakan alat elektronik yang
dirancang untuk dapat mengatur komposisi udara yang akan masuk ke jar dari tabung gas. Komposisi udara yang akan dimasukkan ke jar dapat diatur sesuai
dengan yang diinginkan. Kondisi mikroaerofilik dalam jar anaerob dibuat melalui satu siklus yang terbagi kedalam dua fase; yaitu fase evakuasi dan fase
penggantian. Pada fase evakuasi, oksigen yang ada di dalam jar yang besarnya 21,
dikeluarkan hingga kadar oksigen hanya 6. Untuk mencapai kadar ini, program mikroaerofilik standar anoxomat harus mengeluarkan udara sampai
tekanan udaranya 297 mbar. Pada fase penggantian, sejumlah udara yang dikeluarkan dari jar, digantikan dengan campuran gas bebas oksigen yang
berasal dari tabung gas. Tekanan udara pada kondisi ini mencapai 1040 mbar. Saat kondisi mikroaerofilik tercapai, tekanan udara akhir dalam jar anaerob
adalah 1620 mbar. Anoxomat mempunyai tingkat keakuratan yang tinggi, dengan deviasi kurang dari 0.5 Mart Microbiology, 2004
F. MEDIA AGAR SELEKTIF CAMPYLOBACTER
