33
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan termasuk jenis penelitian eksperimental murni adalah rancangan dengan melibatkan satu variabel eksperimen yang diberikan
perlakuan khusus manipulasi dan satu kelompok kontrol dengan perlakuan yang berbeda setelah itu menguji hasil Nasution, 2007. Rancangan penelitian yang
digunakan adalah rancangan penelitian acak lengkap pola searah yaitu mengidentifikasi karakteristik umum dari anggota populasi tikus jantan galur
Wistar, kemudian menentukan strata atau lapisan dari jenis karakteristasi tersebut umur dan berat badan dan kemudian diambil sampel yang mewakili strata tersebut
secara acak Notoadmojo, 2002. Penelitian ini dilakukan pada subjek uji tikus jantan galur Wistar.
Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah tikus putih jantan galur Wistar dengan umur 1-2 bulan dan bobot hewan uji 100-200 g. Kriteria eksklusi pada
penelitian ini adalah tikus putih jantan galur Wistar dengan umur diluar 1-2 bulan, berat kurang dari 100 g dan lebih dari 200 g serta tikus yang mati.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel utama
1 Varibel bebas Variabel bebas pada penelitian ini adalah dosis serbuk buah pisang
kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. dengan tiga peringkat dosis yang ditentukan peneliti dari konsentrasi terpekat sediaan serbuk buah pisang
kepok yang dapat melewati spuit peroral sebagai berikut: 1,9 ; 3,8 ; 7,6 gKg BB.
2 Variabel tergantung Variabel tergantung adalah kadar trigliserida dalam darah tikus jantan
galur Wistar. b. Variabel pengacau
1 Variabel pengacau terkendali Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah jenis
kelamin hewan uji, galur hewan uji, umur, berat badan dari hewan uji. Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Wistar dengan
berat badan 100-200 g dan umurnya 1-2 bulan. Jalur pemberian sediaan serbuk buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. dilakukan
secara peroral yang sebelumnya serbuk disuspensikan ke dalam larutan CMC 1 bv.
2 Variabel pengacau tak terkendali Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah
keadaan patofisiologi hewan uji, kemampuan hewan uji untuk mencerna serbuk buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. absorbsi,
distribusi, biotransformasi, dan ekskresi serta kemampuan hewan uji untuk beradaptasi dengan hiperlipidemia.
2. Definisi operasional
a. Komposisi pakan tinggi lemak yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari kuning telor ayam, minyak babi dan AD II dengan perbandingan 2:1:1
dibuat dalam bentuk pelet. Komposisi pakan ini efektif mampu meningkatkan kadar trigliserida dalam darah tikus.
b. Serbuk buah pisang kepok adalah serbuk yang dibuat dengan mengeringkan buah pisang kepok dalam oven kemudian menghancurkan pisang kepok
Musa x paradisiaca L. pro sp. dengan menggunakan mesin penyerbuk yaitu grinder, dan serbuk yang diperoleh dapat dibuat dalam bentuk sediaan
suspensi serta dapat melewati spuit injeksi peroral. c. Sediaan serbuk buah pisang kepok adalah sediaan dalam bentuk suspensi buah
pisang kepok yang dibuat dengan melarutkan sejumlah g serbuk buah pisang kepok dalam larutan CMC 1 bv.
d. Dosis serbuk Musa x paradisiaca L. pro sp. adalah sejumlah serbuk Musa x paradisiaca
L. pro sp. yang disuspensikan dalam larutan CMC 1 bv dan diberikan kepada tikus dengan rute pemberian peroral berdasarkan jumlah
pakan yang dimakan tikus per hari selama masa perlakuan. e. Metode kolorimetrik dengan reagen GPO Glycerol-3-Phosphate-Oxidase
adalah suatu metode enzimatik yang dapat digunakan untuk mengukur kadar trigliserida darah.
C. Bahan dan Instrumen Penelitian
1. Bahan penelitian
a. Hewan uji Hewan uji yang digunakan berupa tikus jantan galur Wistar dengan umur
1-2 bulan dan berat badan 100-200 g yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata DharmaYogyakarta.
b. Bahan uji Buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. mentah hijau tanpa
kulit berumur 2,5 bulan yang diperoleh dari Mejing wetan RT 01RW 07, Ambarketawang, Gamping, Sleman. Pisang kepok yang digunakan pada
penelitian ini diambil pada bulan September 2012. Bahan uji ini kemudian dikeringkan dan dijadikan serbuk.
c. Lemak babi Lemak babi yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari Pasar
Bringharjo Yogyakarta. d. Kuning telur
Kuning telur yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari warung di Paingan, Maguwohardjo, Sleman, Yogyakarta.
e. Pakan Pakan yang digunakan secara umum adalah pakan AD II yang didapat dari
Laboratorium Hayati Imono Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
f. Pakan tinggi lemak Pakan tinggi lemak dibuat dari campuran kuning telor ayam, minyak babi
dan AD II, dengan perbandingan 2:1:1 dibuat dalam bentuk pelet. g. Larutan CMC 1 bv
Serbuk CMC dibuat menjadi larutan dengan konsentrasi 1 bv. h. Senyawa pembanding
Senyawa pembanding yang digunakan adalah tablet simvastatin generic 20 mg.
2. Instrumen penelitian
Alat atau instrumen yang digunakan pada penelitian ini adalah seperangkat alat gelas, oven, alat timbang elektrik Mettler Toledo AB 204, Switzerland, alat
penyerbuk grinder, ayakan berukuran 80 mesh, mesin pelet, pipa hematokrit non- heparin, set metabolit cage, serum tube 6 cc BD Vacutainer, spuit injeksi peroral
2,5 cc dan 5 cc, penangas air.
D. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi dilakukan dengan menyamakan ciri-ciri buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. dengan website
www.plantamor.com dan buku
Atlas Tumbuhan Obat Indonesia.
2. Pengumpulan bahan
Buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Mejing wetan RT 01RW 07, Ambarketawang, Gamping,
Sleman. Buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. yang digunakan adalah buah pisang yang masih mentah berumur 2,5 bulan tanpa kulit.
3. Pembuatan serbuk buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp.
Dari tiga sisir buah pisang kepok yaitu 60 buah pisang kepok 3.600 g yang telah dikumpulkan dipisahkan antara kulit dan daging buahnya kemudian daging
buahnya dipotong-potong dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40
o
C – 50
o
C selama ± 24 jam di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dan didapatkan buah pisang kepok kering dengan berat 2.046 g. Kemudian buah pisang kepok yang telah kering dikeluarkan
dari oven dan diserbuk dengan mesin grinder Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Serbuk buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. yang dihasilkan oleh penyerbukan dengan menggunakan grinder diayak dengan menggunakan ayakan
nomor mesh 50 adalah 612 g dari 60 buah pisang kepok. Diasumsikan dengan ayakan nomor mesh 50, partikel serbuk dapat dibuat dalam bentuk sediaan suspensi yang
diberikan pada tikus jantan galur Wistar dengan bantuan spuit peroral. Satu buah pisang kepok dengan berat 60 g menghasilkan 34,1 g buah pisang kepok yang telah
dioven dan 10,2 g serbuk buah pisang kepok.
4. Penetapan dosis serbuk buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp.
Konsentrasi maksimum sediaan serbuk Musa x paradisiaca L. pro sp. yang digunakan dalam penelitian ini adalah 30 bv. Konsentrasi 30 bv
diperoleh dari konsentrasi terpekat yang ditentukan oleh peneliti sebagai konsentrasi maksimal yang masih bisa dikeluarkan melalui spuit untuk tikus
jantan galur Wistar dengan pemberian peroral. Dari konsentrasi maksimum yang diperoleh dapat dihitung besar dosis sediaan serbuk Musa x paradisiaca L. pro
sp. akan diberikan pada tikus jantan galur Wistar dengan menggunakan rumus berikut ini:
D gg BB x BB g = V ml x C gml Volume pemberian pada tikus yang digunakan pada penelitian ini adalah
setengah dari volume maksimal untuk penggunaan peroral pada tikus yaitu 2,5 ml. Volume maksimum pemberian peroral untuk tikus adalah 5 ml. Pada
penelitian ini diasumsikan berat badan maksimal yang digunakan adalah 200 g, maka dosis pemberian untuk tikus dapat ditentukan sebagai berikut:
Dgg BB x BBg = VmL x CgmL
Dgg BB x 200g = 2,5 mL x 30 g100 mL
DggBB =
Dgg BB = 0,75 g 200 g BB
= 3,75 gKg BB ≈ 3,8 gKg BB
Dosis yang diperoleh adalah 3,8 gKg BB. Kemudian dari dosis 3,8 gKg dosis II BB dibuat tiga peringkat dosis dengan mengambil rentang dosis
yang lebih rendah dosis I dan lebih tinggi dosis III. Untuk mendapatkan dosis yang diinginkan diperlukan faktor pengali dan pembagi. Pada penelitian ini
faktor pengali dan pembagi yang digunakan adalah 2. Oleh sebab itu, tiga peringkat dosis yang digunakan adalah 1,9 gKg BB ; 3,8 gKg BB ; dan 7,6
gKg BB.
5. Pembuatan larutan CMC 1 bv
Serbuk CMC ditimbang sebanyak 1 g dan dilarutkan kedalam aquadest panas sampai 100 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan CMC 1.
6. Pembuatan suspensi serbuk buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro
sp. Serbuk buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. sebanyak 30 g
disuspensikan kedalam larutan CMC 1 sampai 100 mL. Sehingga didapat suspensi
serbuk buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. dalam 30 bv. 7.
Penentuan dosis dan konsentrasi simvastatin
Dosis simvastatin yaitu 20 mg untuk manusia dengan berat badan 70 kg. Kemudian dikonversikan pada tikus 200 g dengan faktor konversi 0,018 yaitu
20 mg x 0,018 = 0,36 mg simvastatin200g = 1,8 mgkg BB, maka dosis simvastatin untuk tikus ditetapkan 1,8 mgkgBB = 0,0018 gKg BB.
Sedangkan penentuan konsentrasi simvastatin pada penelitian ini didasarkan pada perhitungan berikut:
8. Pembuatan suspensi simvastatin
Timbang serbuk simvastatin setara dengan 60 mg simvastatin murni, larutkan dengan CMC 1 dalam labu takar 10,0 ml sebagai larutan induk
simvastatin. Kemudian buat konsentrasi 0,144 mgml dalam labu takar 10,0 ml dari larutan induk simvastatin tersebut. Pembuatan suspensi simvastatin menggunakan
CMC 1 sebagai pelarut dikarenakan menurut United States Pharmcopeia, simvastatin
praktis tidak larut air.
9. Pembuatan pakan tinggi lemak
Pakan yang dibuat komposisi utamanya adalah kuning telor ayam, minyak babi dan AD II dengan perbandingan 2:1:1 yang dibuat oleh Laboratorium
Formulasi dan Teknologi Sediaan Solid-Liquid dengan cara menggiling atau memblender pakan AD II sampai halus. Kemudian dicampurkan dengan kuning telur
ayam dan minyak babi sampai terbentuk adonan. Adonan yang telah jadi digiling dalam mesin penggiling Hobart 7807 02 04. Hasil penggilingan kemudian
dikeringkan dalam oven dengan suhu 60
o
C selama 3- 5 hari.
10. Penentuan waktu pemberian pakan tinggi lemak
Lama pemberian pakan tinggi lemak dilakukan dengan orientasi selama 21 hari. Pemeriksaan terhadap kadar trigliserida dilakukan sebanyak empat kali yaitu
pada hari ke-0, 7, 14 dan 21. Dari hasil pengukuran kadar trigliserida dapat dilihat kapan waktu tikus jantan galur Wistar mengalami kenaikan kadar trigliserida yang
ditunjukan dengan adanya perbedaan yang bermakna dengan uji statistik.
11. Pengkondisiaan hewan uji
Tikus yang telah berumur 1-2 bulan dipelihara sampai bobotnya mencapai lebih dari 100 g atau 2 minggu pemeliharaan untuk mengondisikan tikus dalam
suasana Laboratorium Hayati Imono. Selama 2 minggu tikus diberi pakan biasa, yaitu AD II. Dipilih tikus berumur 1-2 bulan karena pertumbuhannya belum sempurna
sehingga diharapkan dalam masa pertumbuhan tersebut dapat menginduksi pakan
tinggi lemak. 12.
Tahap perlakuan
a. Tikus yang telah dikondisikan dibagi dalam tujuh perlakuan, masing-masing
perlakuan terdiri dari lima tikus yang diberi perlakuan selama 14 hari. b. Perlakuan hewan uji yang dilakukan:
1 Kontrol negatif: tikus diberi pakan AD II dan diberi larutan CMC 1
bv.
2 Kontrol pakan tinggi lemak: tikus diberi pakan tinggi lemak dan diberi
larutan CMC 1 bv.
3 Kontrol positif: tikus diberi pakan tinggi lemak dan diberi suspensi
simvastatin dengan dosis 1,8 mgKg BB.
4 Kontrol pisang: tikus diberi pakan AD II dan diberikan dosis III 7,6 gKg
BB serbuk buah pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp..
5 Perlakuan I: tikus diberi pakan tinggi lemak dan diberi serbuk buah
pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. dengan dosis I yaitu 1,9
gKg BB. 6 Perlakuan II: tikus diberi pakan tinggi lemak dan diberi serbuk buah
pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. dengan dosis II yaitu 3,8
gKg BB. 7 Perlakuan III: tikus diberi pakan tinggi lemak dan diberi serbuk buah
pisang kepok Musa x paradisiaca L. pro sp. dengan dosis III yaitu 7,6
gKgBB.
13. Penetapan kadar trigliserida darah
Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan sebagai hari ke-0 dan setelah perlakuan pada hari ke-14. Kemudian kadar trigliserida darah
diukur dengan menggunakan metode enzimatik kolorimetri dengan reagen GPO Glycerol-3-Phosphate-Oxidase. Prinsipnya adalah trigliserida akan dihidrolisis
menjadi gliserol. Gliserol yang terhidrolisis akan terfosforilasi oleh adenosin triphosphate
ATP dengan adanya glyserol kinase menghasilkan glyserol-3- phosphate
dan adenosie diphosphate ADP. Glyserol-3-phosphate teroksidasi menjadi phosphate dihydroxiacetone DAP oleh glyserol phosphate oxidase GPO
memproduksi hydrogen peroxide. Hidrogen peroksida akan bereaksi dengan 4- aminoantipyrine
dan 4-klorofenol menghasilkan senyawa dengan warna merah chinonimina. Absorbansi chinonimina sebanding dengan konsentrasi trigliserida
muncul dalam sampel yang diukur. Pengukuran ini akan dilakukan di Laboratorium Parahita, Jl. DR Soetomo 41 Yogyakarta.
E. Tata Cara Analisis Hasil
Data kadar trigliserida darah dilakukan uji distribusi menggunakan uji Kolmogorov Smirnov
kemudian jika distribusinya normal dilanjutkan dengan analisis One Way Anova
dan Post Hoc Tests Scheffe dengan tingkat kepercayaan 95.
45
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman perlu dilakukan untuk memastikan bahwa bagian tanaman yang digunakan benar berasal dari tanaman Musa x paradisiaca L. pro
sp. sehingga tidak terjadi kesalahan dalam penyiapan bahan uji penelitian. Determinasi mengacu pada
www.plantamor.com dan buku Atlas Tumbuhan Obat
Indonesia 2003 dan didapatkan hasil yang menunjukan ciri-ciri serupa. Hal ini menunjukkan bahwa bahan yang digunakan pada penelitian ini memang benar
tanaman Musa x paradisiaca L. pro sp..
B. Pembuatan Pakan Tinggi Lemak
Pakan yang digunakan pada penelitian ini adalah jenis pakan tinggi lemak. Tujuan pembuatan pakan tinggi lemak adalah untuk menginduksi
peningkatan kadar trigliserida darah tikus jantan galur Wistar. Pembuatan pakan tinggi lemak dikerjakan di Laboratorium Formulasi-Teknologi Semi-Solid Liquid
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Komposisi pakan tinggi lemak terdiri dari kuning telor ayam, minyak babi dan BR II dengan perbandingan 2:1:1
yang didasarkan pada orientasi penelitian yang dilakukan oleh Hendra, dkk 2010. Pakan yang digunakan adalah BR II, tetapi pada penelitian ini diganti
dengan AD II untuk menyesuaikan kondisi tikus jantan galur Wistar di Laboratorium Imono yang diberi pakan AD II sebelum digunakan untuk
Kategori