b. ACTH adjustor, larutkan setial vial dengan 4 ml air terdestilasi. Larutan stabil selama 2 bulan pada suhu -20
°
C. c. ACTH sample diluent LACZ, stabil selama 6 bulan pada
suhu -20
°
C. 4. Spesimen yang digunakan adalah plasma. Darah vena
dimasukkan ke dalam tabung EDTA. Plasma dipisahkan dan disimpan pada suhu -20
°
C dan stabil dalam 4 bulan. 5. Prosedur kerja:
Prosedur persiapan, dilusi, adjustment, pemeriksaan, dan quality control dilakukan sesuai dengan manual operasional Immunolite
1000 ACTH.
g. Pemeriksaan kadar 11-
β Hydroxylase serum
Pemeriksaan kadar11- β hydroxylase serum dilakukan dengan
teknik quantitative sandwich enzyme immunoassay. 1. Prinsip pemeriksaan:
Sumur dalam microplate telah dilapisi dengan antibodi spesifik terhadap 11-
β hydroxylase.Standar dan sampel dipipet ke dalam sumur dan sebagian 11-
β hydroxylase yang ada diikat oleh antibodi.Setelah menghilangkan semua substans yang
tidak berikatan, biotin-conjugated antibody yang spesifik untuk 11-
β hydroxylase ditambahkan ke dalam sumur. Setelah pencucian, avidin conjugated horseradish peroxidase HRP
ditambahkan ke dalam sumur. Setelah pencucian untuk
Universitas Sumatera Utara
menghilangkan reagen avidin-enzyme yang tidak berikatan, suatu
larutan tetramethylbenzidine
TMBsubstrate ditambahkan ke dalam sumur dan terbentuklah warna yang
dibaca pada microplate reader.Intensitas warna yang terbentuk proporsional dengan jumlah 11-
β hydroxylase yang terikat pada tahap awal.
2. Reagensia yang digunakan terdiri dari Biotin-antibody 1x, horseradish peroxidase avidin HRP-avidin 1x, dan Wash
Buffer 1x. 3. Spesimen yang digunakan pada pemeriksaan ini adalah serum.
4. Persiapan reagen, standar, dan sampel: a. Biotin-antibody 1x
Vial disentrifugasi sebelum dibuka. Biotin-antibody perlu diencerkan 100 kali, 10
μl biotin-antibody dicampurkan dengan 990
μl Biotin-antibody diluent. b. Horseradish peroxidase avidin HRP-avidin 1x
Vial disentrifugasi sebelum dibuka.HRP-avidinperlu diencerkan 100 kali, 10
μl HRP-avidindicampurkan dengan 990
μl HRP-avidin diluent. c. Wash Buffer 1x
Sebanyak 20 ml wash buffer concentrate 25x diencerkan ke dalam air terdestilasi untuk menyiapkan
500 ml wash buffer 1x.
Universitas Sumatera Utara
d. Standar Vial yang berisi standar disentrifugasi pada 6000-10000
rpm selama 30 detik. Standar dilarutkan dengan 1 ml pelarut sampel.Larutan ini digunakan menjadi larutan
stok dengan konsentrasi 1500 pgml S7. Larutan stok ini kemudian diencerkan secara berseri dengan faktor
pengenceran 2x dengan mengambil 250 μl larutan standar
dan menambahkan 250 μl pelarut sampel S6-S1. Pelarut
sampel sebanyak 250 μl dimasukkan ke dalam tabung
sebagai standar nol 0 pgml. 5. Prosedur pemeriksaan:
a. Seluruh reagen, standar, dan sampel diletakkan pada suhu ruangan.
b. Sebanyak 100 μl standar dan sampel ditambahkan ke
dalam tiap sumur microplate. Permukaan sumur ditutup dengan selotip yang disediakan pada kit kemudian
diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37
°
C. c. Cairan pada setiap sumur dipindahkan tanpa dicuci.
d. Sebanyak 100 μl biotin-antibody 1x ditambahkan pada
setiap sumur. Permukaan sumur ditutup dengan selotip yang baru kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu
37
°
C.
Universitas Sumatera Utara
e. Setiap sumur diaspirasi dan dicuci, prosedur tersebut diulang sebanyak 2 kali. Sumur dicuci dengan cara
mengisi setiap sumur dengan wash buffer 200 μl
menggunakan pipet dan biarkan selama 2 menit. f. Sebanyak 100
μl horseradish peroxidase avidin HRP- avidin 1x ditambahkan ke dalam setiap sumur.
Permukaan sumur ditutup dengan selotip yang baru dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
°
C. g. Aspirasi proses pencucian diulang sebanyak 5 kali pada
tahap 6. h. Sebanyak 90
μl tetramethylbenzidine TMB substrate ditambahkan pada setiap sumur, kemudian diinkubasi
selama 15-30 menit pada suhu 37
°
C. Sumur dilindungi dari cahaya.
i. Sebanyak 50 μl stop solution ditambahkan pada setiap
sumur, kemudian plate dihentakkan dengan perlahan untuk mencampur larutan.
j. Menentukan densitas optikal setiap sumur selama 5 menit dengan menggunakan microplate reader pada gelombang
450nm. k. Menentukan kadar 11-
β hydroxylase sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar yang dibuat
dengan menggunakan program Curve Expert 1,3.
Universitas Sumatera Utara
Prinsip penentuan kadar sampel dengan kurva standar: i.
Letakkan nilai densitas optikal standar pada sumbu X, dan nilai konsentrasi standar pada
sumbu Y. ii.
Menghubungkan titik-titik yang berdekatan dan membentuk kurva standar. Tentukan kadar sampel
dengan meletakkan nilai densitas pada sumbu X, menarik garis yang memotong kurva linear yang
dibentuk oleh standar kurva standar kemudian mencari nilai konsentrasi pada sumbu Y.
Gambar 3.2 Contoh Kurva Standar 11β-hydroxylase
3.10 Pengolahan dan Analisis Data
