24
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan rancangan penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak sederhana
B. Variabel
1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu
kemiri. 2.
Variabel tergantung berupa kemampuan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri untuk menangkap radikal DPPH IC.
3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu
pemanenan, umur benalu yang dipanen, cara panen, dan jumlah g serbuk daun benalu yang digunakan.
4. Variabel pengacau tak terkendali berupa cuaca atau musim.
C. Definisi
1. Daun benalu kemiri adalah daun benalu dari pohon kemiri disekitar halaman
kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta.
2. Ekstrak etanol daun benalu kemiri adalah sari hasil proses maserasi simplisia
kering daun benalu kemiri dengan menggunakan pelarut etanol 70.
24 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
3. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak etanol daun benalu kemiri
yang telah diekstraksi cair-cair dengan air : washbensin kemudian fase air
diekstraksi cair-cair dengan etil asetat p.a.
4. Persen inhibition concentration IC adalah persen kemampuan fraksi etil
asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri untuk menangkap radikal DPPH.
5. Inhibition concentration 50 IC
50
adalah nilai konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri yang menghasilkan penangkapan 50
radikal DPPH dilihat dengan pengurangan absorbansinya menggunakan
spektofotometri visible.
D. Bahan dan alat 1. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: daun benalu S.atropurpurea
B1. Dans yang diambil dari pohon kemiri yang terdapat di sekitar halaman kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan ,Yogyakarta
pada bulan juli 2014 ; akuades CV. General Laboratorium; bahan kualitas p.a.
E. Merck, yaitu: metanol, bahan kualitas p.a. SigmaChem. Co., USA, yaitu: DPPH, reagen Folin-Ciocalteu, asam galat, dan kuersetin; bahan
kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu: wasbensin dan etil asetat kualitas p.a ; bahan kualitas teknis CV. General Laboratorium, yaitu: etanol 70 .
2. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa spektrofotometer UV-Vis Shimadzu, Uvmini-1240, vortex junke kunkel, corong Buchner,
26
blender, mikropipet 10-1000 µL; 1-10 mL Acura 825, Socorex, neraca analitik Scaltec SBC 22, BP 160P, vacuum rotary evaporator R-3 Butci,
waterbath , tabung reaksi bertutup dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di
laboratorium analisis Pyrex-Germany dan Iwaki, aluminium foil, desikator cawan petri dan kertas timbang.
E. Metode Penelitian 1. Determinasi tanaman dengan cara membandingkan ciri dan sifat
Determinasi daun benalu dilakukan di Bagian Biologi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan cara membandingkan ciri dan
sifat sampel dengan buku Flora of Java. Determinasi dilakukan oleh determinator Bapak Djoko Santosa, M.si. Determinasi tanaman ini untuk
memastikan bahwa yang digunakan untuk penelitian benar-benar daun benalu S.atropurpurea
B1. Dans.
2. Pembuatan dan penyiapan bahan
a. Pengumpulan bahan
Daun benalu kemiri diambil dari pohon kemiri yang terdapat di sekitar halaman kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan
Yogyakarta. Pengumpulan pada bulan Juli tahun 2014. Pemanenan dilakukan pagi hari pukul 09.00 WIB.
27
b. Sortasi basah
Daun benalu dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti bagian tanaman yang tidak dibutuhkan ranting, bunga dan akar dan
bahan-bahan rusak lainnya. c.
Pencucian Daun benalu dicuci dengan cara dialiri air mengalir sambil
dibersihkan dari kotoran yang melekat. d.
Pengeringan Daun benalu yang masih basah dikeringan dengan cara dijemur
dibawah sinar matahari dan ditutupi dengan kain hitam. Akhir pengeringan ditandai dengan mudah dipatahkannya bagian per bagian
daun benalu tersebut. e.
Sortasi kering Daun benalu yang sudah kering ditandai dengan mudah hancur ketika
diremas kemudian dipisahkan dari bahan-bahan penggangggu seperti bagian batang dan bahan-bahan yang rusak tanpa pencucian.
f. Perajangan atau pembuatan serbuk simplisia
Daun benalu yang sudah kering dibuat menjadi serbuk dengan blender lalu dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor mesh 40.
g. Pengepakan dan penyimpanan
Serbuk daun benalu kemiri kemudian disimpan diwadah yang kedap udara dan disimpan ditempat kering dan sejuk.
28
3. Preparasi Sampel
a. Ekstraksi sampel
Daun benalu kemiri yang telah menjadi serbuk ditimbang sebanyak 30,0 g dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi ukuran 300 ml
, ditambah dengan 100 ml etanol 70 sampai terendam sempurna dan
dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama tiga hari dengan alat shaker. Filtrat diperoleh melalui penyaringan
menggunakan kertas saring kasar dengan bantuan corong Buchner dan pompa vakum. Ampas penyaringan diremaserasi dengan 100 ml etanol
70 kembali selama dua hari. Kemudian filtrat yang didapat dicampur dengan filtrat terdahulu. Keseluruhan filtrat diuapkan pelarutnya dengan
vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental etanol daun
benalu kemiri. Selanjutnya ekstrak kental di letakkan di atas waterbath hingga bobot tetap.
4. Pembuatan fraksi etil asetat
Ekstrak etanol daun benalu kemiri dilarutkan dalam 300 ml air hangat dan dilakukan ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dengan
perbandingan larutan ekstrak : wash bensin 1:1 vv, diamkan hingga terpisah sempurna. Fase air akan berada dibawah sedangkan fase wash bensin
akan berada diatas. Dari hasil ekstrasi tadi diperoleh dua fraksi yaitu air dan wash
bensin. Fraksi yang diambil yaitu fraksi air untuk kemudian diekstraksi dengan
menggunakan etil asetat p.a 1:1 vv, sehingga didapatkan fraksi air dan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
fraksi etil asetat. Ambil fraksi etil asetat. Kemudian fraksi etil asetat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator dan selanjutnya diletakkan
diatas waterbath hingga bobot tetap. Fraksi yang didapat disimpan didalam desikator hingga digunakan untuk analisis lebih lanjut.
5. Pembuatan larutan pembanding, DPPH dan uji
a. Pembuatan larutan uji
1. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu dilarutkan dengan 10,0 mL metanol p.a sehingga diperoleh
konsentrasi sebesar 1000,0 µgmL. Kemudian sebanyak 1,0 mL larutan tersebut dilarutkan dengan 10,0 mL metanol p.a sehingga
diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100,0 µgmL. 2.
Larutan uji untuk aktivitas antioksidan Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan
dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet, sebanyak 1,0 mL stok
larutan uji dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0
gmL. Sebanyak 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 mL larutan tersebut, kemudian dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga
diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 7,5; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5 g mL.
30
3. Pembuatan larutan baku asam galat
Sebanyak 10,0 mg asam galat ditimbang, lalu dilarutkan dengan 10,0 mL akuades : metanol p.a 1:1 sehingga diperoleh
konsentrasi larutan asam galat sebesar 1000,0 µ gmL. Sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 dan 1,5 mL larutan tersebut, kemudian
dilarutkan dengan akuades : metanol p.a 1:1 sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat 50; 75;
100; 125; dan 150 µgmL. b.
Pembuatan larutan DPPH Sebanyak 0,0158 g DPPH dilarutkan dengan metanol p.a
sampai 100 mL sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus
selalu dibuat baru. c.
Pembuatan larutan stok dan intermediet kuersetin Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a
sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet, sebanyak 1,0 mL larutan stok kuersetin dan dilarutkan
dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 gmL. Sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5
mL larutan kuersetin konsentrasi 100,0 gmL, kemudian dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi
larutan pembanding kuersetin sebesar 5,0; 7,5; 10,0 12,5; dan 15,0 gmL.
31
6. Uji Pendahuluan
A. Uji pendahuluan kandungan fenolik total a.
Larutan Blanko
Sebanyak 10,0 mL akuades : metanol p.a 1:1 dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-
Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1 :10 vv. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M.
b. Kontrol Positif
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian dilarutkan dengan 5 mL reagen Folin-
Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1 :10 vv. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M.
Vortex selama 15 detik. Amati perubahan warna yang terjadi. c.
Larutan uji Sebanyak 0,5 mL larutan uji dimasukkan ke dalam tabung
reaksi. Kemudian dilarutkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1 :10 vv. Selanjutnya larutan tersebut
ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M. Vortex selama 15 detik. Amati perubahan warna yang terjadi.
d. Larutan Asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 10,0 mL akuades : metanol p.a
1:1 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
e. Larutan uji
Sebanyak 0,5 mL larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 10,0 mL akuades : metanol p.a 1:1
B. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
a. Larutan kuersetin
Sebanyak 10,0 mg kuersetin dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL
b. Larutan Uji
Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL di dalam tabung reaksi.
c. Larutan DPPH
Sebanyak 1 mL larutan DPPH dilarutkan dengan 3 mL metanol p.a dimasukkan kedalam tabung reaksi dan divortex selama 30
detik d.
Larutan uji + DPPH Sebanyak 1 mL larutan uji ditambahkan 1 mL larutan
DPPH dimasukkan kedalam tabung reaksi kemudian dilarutkan dengan 3 mL metanol p.a dan vortex selama 30 detik. Selama 30 menit
diamati perubahan warna yang terjadi. Larutan kuersetin + DPPH
Sebanyak 1 mL larutan pembanding kuersetin ditambahkan 1 mL larutan DPPH, dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian dilarutkan
dengan 3 mL metanol p.a dan vortex selama 30 detik. Selama 30 menit
e.
33
diamati perubahan warna yang terjadi.
7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
a. Penentuan operating time OT asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 µ gmL dilarutkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan
dengan akuades 1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu dibaca absorbansinya
dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang teoritis 750 nm selama 30 menit dengan waktu pengamatan setiap 5 menit. Hasil
percobaan dapat dilihat di Lampiran 6. b.
Penentuan panjang gelombang maksimum asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 µ gmL
ditambahkan dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades 1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambahkan
dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M dan diamkan selama operating time,
kemudian di scanning dengan spektrofotometer visibel pada rentang panjang gelombang antara 600-800 nm. Hasilnya dapat dilihat
pada lampiran 6.
8. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan seri baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 gmL ditambah dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang
telah diencerkan dengan akuades 1:10 vv. Larutan selanjutnya PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M lalu diamkan selama operating time
setelah itu dibaca pada panjang gelombang maksimum yang didapat 739 nm. Pengerjaan dilakukan tiga kali.
b. Pembuatan kurva baku asam galat
1. Membuat seri larutan baku asam galat dengan konsentrasi 50, 75,
100. 125 dan 150 gmL 2.
Masing-masing seri larutan baku asam galat dengan konsentrasi diatas diukur nilai absorbansinya pada = 739 nm
3. Mencatat nilai absorbansi masing-masing seri larutan baku asam
galat 4.
Membuat kurva standar hubungan konsentrasi vs absorbansi 5.
Selanjutnya masukkan ke persamaan regresi linier kurva baku Y=bx+a hasilnya dapat dilihat pada lampiran 7.
c. Validasi metode penetapan fenolik total asam galat. Hasil dari
prosedur 8a divalidasi berdasarkan presisi CV dan linearitas nilai r.
� = � � �
�� � � � � �
� � � − � � �
� � �
�
d. Penetapan kandungan fenolik total larutan uji
Sebanyak 0,5 mL larutan uji dengan konsentrasi 102 gmL, kemudian ditambah dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang
telah diencerkan dengan akuades 1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1M lalu diamkan selama
operating time , dibaca pada panjang gelombang maksimum yang
35
didapat 739 nm. Pengerjaan dilakukan tiga kali Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat
ekstrak etanol. Hasil penetapan kandungan fenolik total dapat dilihat di lampiran 7.
9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
e. Penentuan operating time OT
Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing- masing tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2,0
mL larutan pembanding kuersetin 5,0; 10,0 dan 15,0 gmL
Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian digojok dengan
vortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 515 nm selama 1
jam, dan hal diatas dikerjakan juga untuk larutan uji dengan konsentrasi 7,5; 12,5; 17,5 gmL. Hasilnya ada di lampiran 10.
f. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Pada tiga labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH 0,4 mM. Larutan tersebut dilarutkan dengan
metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan tersebut kemudian digojok
dengan vortex selama 30 detik. Diamkan selama operating time, kemudian di scanning dengan spektrofotometer visibel pada
rentang panjang gelombang antara 400-600 nm. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
10. Uji aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH kontrol
Pada labu ukur 10 mL, dimasukkan sebanyak 2,0 mL larutan DPPH lalu dilarutkan dengan metanol p.a hingga tanda batas.
Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga
kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL kemudian ditambah dengan 2,0 mL larutan pembanding
dan uji pada berbagai konsentrasi yang telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut dilarutkan dengan metanol p.a hingga tanda batas.
Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik dan didiamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan tiga kali optimasi.
c. Penetapan aktivitas antioksidan
Dari hasil dari pengukuran absorbansi 10 b dihitung nilai IC dan IC
50
untuk kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri.
37
F. Analisis Hasil
Kandungan fenolat total dalam daun benalu kemiri dinyatakan dalam GAE gallic acid equivalent yaitu jumlah kesetaraan miligram asam galat dalam 1
gram sampel Lee et al., 2003. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier dengan data kurva baku asam galat secara intrapolasi. Untuk Menghitung
kandungan fenolik total digunakan rumus : Kandungan fenolik total = X
X = kadar fenolik yang diperoleh dari persamaan kurva baku mgmL v = volume akhir larutan dikali faktor pengenceran mL
m = bobot fraksi gram Kusumanto, 2015
Aktivitas penangkapan radikal DPPH IC dihitung dengan rumus :
Absorbansi larutan kontrol − Absorbansi larutan pembanding atau uji Absorbansi larutan kontrol
×
Hardiana, Rudyansyah dan Zaharah, 2012 Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC
50
menggunakan persamaan regresi linier dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun
pembanding, sedangkan sumbu y adalah IC. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi
Penelitian ini dimulai dengan melakukan determinasi pada tanaman yang akan diuji dengan cara membandingkan ciri dan sifat sampel. Determinasi tanaman
sangat penting untuk dilakukan yang bertujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas dari tanaman yang digunakan didalam penelitian ini. Oleh sebab
itu determinasi merupakan langkah awal terpenting di penelitian ini. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah Scurrula
atropurpurea B1. Dans atau dikenal dengan benalu suku loranthaceae. Hal ini
dibuktikan dengan surat determinasi lampiran 1 yang dilakukan di Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
B. Hasil Pengumpulan bahan
Daun benalu kemiri yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari pohon kemiri yang berada di sekitar halaman kampus III Universitas Sanata
Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta. Daun benalu diambil dari tempat yang sama, hal tersebut bertujuan agar variasi kandungan kimia yang
terkandung didalam daun benalu tidak berbeda jauh. Daun benalu dipanen dengan kriteria sebagai berikut yaitu pada saat cuaca kering dan sebelum musim hujan.
Daun benalu dikumpulkan dan diambil yang masih segar. Pemanenan dilakukan pada pagi hari dengan tujuan agar benalu dalam kondisi segar dan menurut
38 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kategori