Identifikasi Escherichia coli HASIL DAN PEMBAHASAN

seperti demam, muntah, diare, gangguan pencernaan lain bahkan dapat menginfeksi sistem saraf.

E. Identifikasi Escherichia coli

Uji identifikasi bakteri yang dilakukan pada penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi adanya cemaran E. coli dalam jamu gendong beras kencur. Uji identifikasi E. coli dari sampel jamu beras kencur terdiri dari beberapa tahap yaitu tahap pengkayaan, tahap isolasi dan uji biokimiawi.

1. Tahap Pengkayaan pada Media Escherichia coli Broth

Tahap pengkayaan merupakan tahap yang bertujuan untuk menumbuhkan bakteri dari sampel jamu beras kencur agar dapat tumbuh optimal pada media pengkaya yang sesuai. Media pengkaya yang digunakan pada penelitian ini adalah Escherichia coli Broth ECB. ECB merupakan suatu media selektif yang dapat mengidentifikasi E.coli baik pada produk makanan, susu maupun minuman termasuk produk berupa jamu beras kencur. Media ECB dapat mendukung pertumbuhan E.coli karena mengandung buffer kaldu laktosa dan garam empedu yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri lain seperti bakteri yang bersporulasi Basillus subtilis maupun enterococci Cappuccino, 2008. Tahap pengkayaan dilakukan dengan mengambil suspensi hasil homogenisasi sampel sebanyak 1 mL dan diinokulasikan pada 9 mL ECB lalu diinkubasi pada suhu 44 o C selama 24 jam. Menurut Radji 2010, suhu 44 o C merupakan suhu pertumbuhan optimum bagi E.coli dan akan memusnahkan bakteri-bakteri lain yang tidak mampu bertahan pada suhu tersebut. Pada uji ini dilakukan kontrol positif yang berisi biakan murni E.coli ATCC 25922. ATCC 25922 merupakan salah satu strain murni bakteri E.coli. E.coli ATCC 25922 biasa digunakan untuk pengujian bakteri pada makanan, minuman maupun antibiotik. E.coli ATCC 29522 memiliki karakteristik bakteri Gram-negatif, patogen, mempunyai antigen O dan bersifat aerob ATCC, 2014. Kontrol positif digunakan untuk mencegah terjadinya bias pada saat pengamatan sampel uji, dengan kata lain kontrol positif dapat digunakan sebagai pembanding apakah reaksi, penampakan dan karakteristiknya sama dengan sampel yang diuji. Apabila sampel menunjukkan hasil yang sama dengan kontrol positif maka dapat disimpulkan bahwa hasil dari tahap pengkayaan adalah positif. Hasil positif akan ditunjukkan dengan adanya kekeruhan dan terbentuknya gas yang terjebak pada tabung Durham yang menandakan bahwa pada sampel yang diuji terdapat bakteri E.coli. Gambar 3. Hasil Uji Pengkayaan E.coli pada media ECB Keterangan : menunjukkan adanya gas yang terjebak pada tabung Durham Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3 K+ K+ K+ A1 A2 C1 A3 C2 C3 B3 B2 B1 K+ : Kontrol positif dari biakan murni E.coli ATCC 25922 A1 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 1 terbentuk gas pada tabung Durham A2 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 2 terbentuk gas pada tabung Durham A3 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 3 terbentuk gas pada tabung Durham B1 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 1 terbentuk gas pada tabung Durham B2 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 2 terbentuk gas pada tabung Durham B3 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 3 terbentuk gas pada tabung Durham C1 : Sampel jamu Pedagang 3 replikasi 1 tidak terbentuk gas pada tabung Durham C2 : Sampel jamu Pedagang 3 replikasi 2 tidak terbentuk gas pada tabung Durham C3 : Sampel jamu Pedagang 3 replikasi 3 tidak terbentuk gas pada tabung Durham Berdasarkan hasil yang diperoleh setelah inkubasi selama 24 jam Gambar 3, sampel jamu beras kencur dari Pedagang 1 dan 2 menunjukkan hasil yang sama dengan kontrol positif yaitu berubah menjadi keruh dan timbul gas pada tabung Durham, sedangkan pada sampel 3 yang merupakan sampel jamu beras kencur dari Pedagang 3 menunjukkan hasil negatif yaitu tidak terdapat gelembung gas pada tabung Durham serta tabung tidak mengalami kekeruhan. Gelembung gas dan kekeruhan yang muncul pada tabung menandakan bahwa bakteri yang berada dalam sampel mampu memfermentasikan laktosa yang terkandung pada media ECB dan dapat memproduksi gas. Laktosa merupakan polisakarida yang harus dipecah terlebih dahulu agar dapat masuk ke dalam sel bakteri. Laktosa kemudian dipecah oleh enzim β-galaktose menjadi glukosa dan galaktosa. Glukosa yang dihasilkan selanjutnya akan dibawa masuk ke dalam sel bakteri dengan jalur transport aktif. Glukosa pada mikroba aerob diproses menjadi asam piruvat melalui jalur glikolisis. Asam piruvat yang dihasilkan akan melalui siklus kreb dan menghasilkan asam-asam campuran dan gas CO 2 . Munculnya gelembung gas dan kekeruhan pada tabung Durham terkait kemampuan bakteri dalam sampel yang mampu memfermentasikan laktosa didukung oleh pernyataan Cappucino 2008 yang menyatakan bahwa bakteri E.coli mampu memfermentasikan laktosa dan akan menghasilkan asam-asam campuran seperti asam laktat, asam asetat dan asam format serta menghasilkan gas berupa CO 2 dan H 2. Hasil positif dari uji pengkayaan ditunjukkan oleh sampel Pedagang 1 dan sampel Pedagang 2 selanjutnya akan ditegaskan melalui tahap isolasi bakteri E.coli dengan menginokulasikan ke media Tryptone Bile X-Glucuronide TBX yang merupakan media diferensial untuk Escherichia coli.

2. Tahap Isolasi pada Media Tryptone Bile X-Glucuronide TBX

Tahap isolasi merupakan tahap yang bertujuan untuk mendapatkan koloni bakteri murni. Untuk mendapatkan biakan murni digunakan media selektif yang dapat mengisolasi koloni bakteri berdasarkan karakter biokimia bakteri yang akan mempengaruhi sifat pertumbuhan bakteri pada media spesifik. Identitas bakteri dapat dilihat dari pembentukan koloni yang spesifik pada media yang digunakan BPOM, 2008. Pada penelitian ini tahap isolasi yang dilakukan bertujuan untuk mendapatkan bakteri E.coli murni serta bertujuan untuk menegaskan bahwa bakteri yang tumbuh selama tahap pengkayaan adalah bakteri E.coli. Media yang digunakan untuk isolasi E.coli pada penelitian ini adalah media Tryptone Bile X-Glucuronide TBX. Media TBX merupakan media diferensial dan selektif digunakan untuk isolasi bakteri E.coli. Media TBX mengandung Tryptone yang menyediakan nitrogen dan asam amino bagi pertumbuhan bakteri. Pada media TBX, terdapat χ-β-D-glucuronide yang merupakan agen kromofor yang akan terdeteksi oleh enzim glukoronidase yang terdapat pada E.coli . χ-β-D-glucuronide akan diserap oleh E.coli sehingga ketika E.coli memfermentasikan gula maka χ-β-D- glucuronide akan dilepaskan keluar sel sehingga menyebabkan kromofor menghasilkan warna dan terakumulasi dalam sel-sel koloni, akibatnya koloni yang tumbuh berwarna hijau kebiruan Sears, 2011. Koloni spesifik E.coli yang tumbuh pada media TBX memiliki ciri-ciri bentuk bulat, diameter 2-3 mm, dan berwarna hijau kebiruan dengan kilap logam. Pada tahap isolasi, inokulasi pada media TBX dilakukan secara streak plate bertujuan agar mendapatkan koloni bakteri yang terpisah sehingga mudah untuk diamati dan digunakan untuk uji identifikasi selanjutnya. Teknik streak plate dilakukan dengan menggunakan jarum ose. Sebelum dan sesudah penggunaan, jarum ose dipijarkan dahulu diatas nyala api Bunsen mulai dari pangkal hingga ujung bertujuan untuk mensterilkan jarum dari kontaminan. Selanjutnya didinginkan dahulu kemudian digunakan untuk mengambil satu ose kultur bakteri dan digoreskan pada media agar. Kelemahan dari metode streak plate ini yaitu apabila kurang hati-hati dalam melakukan penggoresan, dapat mengakibatkan rusaknya media akibat jarum ose. Apabila sampel jamu beras kencur menunjukkan reaksi dan penampakan yang sama dengan kontrol positif yang digunakan sebagai pembanding, maka hasil isolasi sampel dinyatakan positif mengandung bakteri E.coli. Gambar 4. Hasil isolasi E.coli pada sampel jamu beras kencur dalam media Tryptone Bile X-Glucuronide TBX Keterangan : tanda panah merah menunjukkan koloni dugaan E.coli yang berwarna hijau kebiruan Kontrol + Replikasi 1 Sampel Pedagang 2 Sampel Pedagang 1 Replikasi 3 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 2 Replikasi 1 Gambar diatas Gambar 4 merupakan hasil pengamatan setelah inkubasi 24 jam. Hasil positif diperoleh pada ketiga replikasi sampel Pedagang 1 maupun sampel Pedagang 2. Pada sampel yang diisolasi terbentuk koloni spesifik berbentuk bulat dan berwarna hijau kebiruan dengan kilap logam seperti yang terlihat pada kontrol positif E.coli ATCC 25922. Selanjutnya koloni hasil isolasi pada media TBX diinokulasikan pada Nutrient Agar miring dalam tabung dan diinkubasi pada suhu 35 o C selama 24 jam. Koloni diinokulasikan pada Nutrient Agar miring bertujuan untuk memperoleh isolat murni dan melihat persamaan bentuk koloni yang tumbuh pada kontrol positif dan koloni yang tumbuh pada sampel uji. Hasil yang didapatkan setelah inkubasi 24 jam yaitu bentuk dan pola koloni yang tumbuh pada Nutrient Agar miring kontrol positif maupun sampel jamu Pedagang 1 dan Pedagang 2 memiliki persamaan yaitu koloni berwarna putih dan keruh, bentuk seperti pedang dan memiliki tepi koloni yang berombak Gambar 5. Kemudian dilakukan uji konfirmasi uji biokimiawi terhadap hasil isolasi yang telah diperoleh untuk menegaskan keberadaan E.coli pada sampel jamu gendong beras kencur dari Pedagang 1 maupun Pedagang 2. Gambar 5. Hasil isolasi E.coli pada sampel jamu beras kencur dalam Nutrient Agar Miring Keterangan : K+ : Kontrol positif biakan murni E.coli ATCC 25922 A1 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 1 A2 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 2 A3 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 3 B1 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 1 B2 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 2 B3 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 3

3. Tahap Identifikasi dan Konfirmasi Keberadaan E.coli

Pada tahap ini dilakukan uji konfirmasi yang bertujuan untuk memastikan dan menegaskan keberadaan bakteri E.coli dalam sampel jamu beras kencur berdasarkan sifat biokimiawinya. Uji konfirmasi yang akan dilakukan juga menggunakan biakan murni bakteri E.coli ATCC 25922 sebagai kontrol positif yang diperlakukan sama dengan sampel yang diuji untuk membandingkan hasil yang diperoleh pada pengujian sampel. Uji konfirmasi yang dilakukan meliputi uji biokimia dan pengecatan Gram. K+ A1 A2 B3 B2 B1 K+ A3 Pengujian biokimia dilakukan dengan uji fermentasi karbohidrat gula-gula, uji sulfur, uji motilitas, uji indol, uji metil merah, uji Voges-Proskauer dan uji sitrat.

a. Uji Fermentasi Karbohidrat

Tujuan dilakukannya uji fermentasi karbohidrat pada penelitian ini yaitu untuk melihat apakah bakteri yang terdapat pada sampel beras kencur yang diuji memiliki kemampuan memfermentasikan jenis gula-gula spesifik yang dapat mencerminkan sifat bakteri E.coli sehingga hasil yang diperoleh dapat digunakan untuk menegaskan dugaan keberadaan E.coli dalam sampel jamu beras kencur. Uji fermentasi karbohidrat dilakukan dengan mengambil satu sengkelit koloni dari media TBX dan diinokulasikan ke dalam tabung yang sudah berisi gula-gula spesifik antara lain glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sukrosa kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Hasil positif adanya E.coli ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna media dari merah menjadi kuning dan terbentuk gas pada tabung Durham. Menurut Cappuccino 2008, bakteri E.coli mampu memfermentasikan karbohidrat dengan menunjukkan hasil positif pada uji glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sukrosa. Perubahan warna media dari merah menjadi kuning disebabkan oleh penambahan indikator Phenol red pada media untuk mengetahui adanya pembentukan asam. Indikator Phenol red akan berubah warna menjadi kuning apabila terjadi penurunan pH menjadi lebih asam. Kondisi asam dihasilkan dari proses fermentasi gula oleh bakteri yang menghasilkan asam piruvat dan asam laktat yang menyebabkan terjadinya penurunan pH. Soemarno 2000 berpendapat bahwa bakteri E.coli merupakan bakteri yang mampu menghasilkan asam piruvat dan laktat dalam proses penguraian gula-gula, sehingga uji fermentasi karbohidrat ini dapat digunakan sebagai uji penegasan atau konfirmasi karakteristik bakteri E.coli. Proses fermentasi karbohidrat akan menghasilkan asam organik seperti asam format, asam laktat dan asam asetat yang disertai dengan gas CO 2 dan H 2 . Untuk mengetahui adanya pembentukan gas maka digunakan tabung Durham. Gas akan masuk ke dalam tabung Durham dan membentuk gelembung gas.

a.1 Uji Fermentasi Glukosa

Uji fermentasi glukosa dilakukan dengan mengambil satu sengkelit koloni dari media NA miring dan diinokulasikan ke dalam tabung yang sudah berisi media glukosa kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Pada uji ini diperoleh hasil positif pada sampel jamu beras kencur dari Pedagang 1 maupun Pedagang 2 pada tiga replikasi yang dilakukan. Sampel menunjukkan perubahan warna media dari merah menjadi kuning serta timbulnya gas pada tabung Durham. Perubahan tersebut juga terjadi pada kontrol positif Gambar 6. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri yang terdapat dalam sampel beras kencur dan kontrol positif biakan murni E.coli ATCC 25922 mampu memfermentasikan glukosa. Gambar 6. Hasil uji fermentasi glukosa pada sampel jamu beras kencur Keterangan : S : Warna merah pada media glukosa sebelum diinkubasi K+ : Kontrol positif biakan murni E.coli ATCC 25922 A1 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 1 A2 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 2 A3 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 3 B1 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 1 B2 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 2 B3 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 3

a.2 Uji Fermentasi Laktosa

Uji fermentasi laktosa bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri dalam sampel jamu beras kencur mampu memfermentasikan laktosa atau tidak. Uji ini dilakukan dengan mengambil satu sengkelit koloni dari media NA miring pada tahap isolasi kemudian menginokulasikan pada media laktosa. Tabung diinkubasikan pada S A3 B1 B2 B3 A2 A1 K+ K+ suhu 37 o C. Hasil positif diketahui setelah proses inkubasi 24 jam yaitu kontrol positif dan sampel yang diuji baik sampel Pedagang 1 maupun Pedagang 2 menunjukkan perubahan warna media dari merah menjadi kuning Gambar 7. Dari hasil yang didapat, menunjukkan bahwa kontrol positif dan bakteri yang tumbuh pada sampel uji mampu memfermentasikan laktosa. Hal tersebut didukung oleh pernyataan Capuccino 2011 yang menyebutkan bahwa bakteri E.coli dapat memfermentasikan laktosa. Gambar 7. Hasil uji fermentasi laktosa pada sampel jamu beras kencur Keterangan : S : Warna merah pada media laktosa sebelum diinkubasi K+ : Kontrol positif biakan murni E.coli ATCC 25922 A1 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 1 A2 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 2 A3 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 3 B1 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 1 B2 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 2 B3 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 3 S K+ A1 A2 A3 K+ B1 B2 B3

a. 3 Uji Fermentasi Manitol

Menurut Soemarno 2000, bakteri E.coli mampu memfermentasikan manitol ditunjukkan dengan perubahan warna pada media manitol dari merah menjadi kuning. Pada penelitian ini uji fermentasi manitol dilakukan dengan mengambil satu sengkelit koloni yang diperoleh dari media NA miring kemudian diinokulasikan ke media manitol yang selanjutnya akan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Sampel jamu beras kencur maupun kontrol positif sama-sama menunjukkan perubahan warna media menjadi kuning setelah inkubasi 24 jam Gambar 8. Hal tersebut memperkuat dugaan bahwa bakteri yang tumbuh dalam sampel jamu beras kencur merupakan E.coli karena menunjukkan karakteristik dan penampakan yang mirip dengan kontrol positif E.coli ATCC 25922. Gambar 8. Hasil uji fermentasi manitol pada sampel jamu beras kencur S K+ A1 A2 A3 B3 B2 B1 K+

a.4 Uji Fermentasi Maltosa

Uji fermentasi maltosa bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri yang terdapat dalam sampel jamu beras kencur mampu memfermentasi maltosa atau tidak. Cara melakukan uji fermentasi maltosa sama seperti uji fermentasi karbohidrat lainnya, yang membedakannya yaitu pada uji ini menggunakan media maltosa. Setelah diinkubasi 24 jam, diperoleh hasil positif uji fermentasi maltosa pada kontrol positif dan sampel jamu beras kencur yaitu ditunjukkan dengan adanya perubahan warna media dari merah menjadi kuning Gambar 9. Dari hal tersebut diketahui bahwa bakteri yang terkandung dalam sampel jamu beras kencur dapat memfermentasi maltosa. Gambar 9. Hasil uji fermentasi maltosa pada sampel jamu beras kencur K+ A1 A2 A3 B3 B2 B1 K+ S

a.5 Uji Fermentasi Sukrosa

Menurut Radji 2010, bakteri E.coli mampu memfermentasikan sukrosa. Uji fermentasi sukrosa pada penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri dalam sampel beras kencur dapat memfermentasi sukrosa atau tidak. Dari tahap isolasi yang telah dilakukan sebelumnya, hasil koloni pada isolasi sampel memiliki karakteristik yang mirip dengan kontrol positif E.coli ATCC 25922. Maka dilakukan uji fermentasi sukrosa ini sebagai salah satu cara untuk menegaskan keberadaan bakteri E.coli dalam sampel jamu beras kencur. Hasil yang didapat setelah menginkubasi koloni dalam media sukrosa selama 24 jam yaitu terjadi perubahan warna media dari merah menjadi kuning Gambar 10. Hal yang sama juga terjadi pada kontrol positif. Perubahan warna yang terjadi menunjukkan bahwa bakteri yang terdapat dalam sampel memiliki kesamaan dengan kontrol positif E.coli ATCC 25922 yaitu sama-sama mampu memfermentasikan sukrosa. Gambar 10. Hasil uji fermentasi sukrosa pada sampel jamu beras kencur Keterangan : S : Warna merah pada media sukrosa sebelum diinkubasi K+ : Kontrol positif biakan murni E.coli ATCC 25922 A1 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 1 A2 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 2 A3 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 3 B1 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 1 B2 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 2 B3 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 3

b. Uji Sulfur H

2 O Pada penelitian ini dilakukan uji sulfur yang bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri yang terdapat dalam sampel jamu beras kencur untuk menguraikan asam amino menjadi sulfur H 2 S. Pengujian ini dilakukan dengan cara mengambil satu sengkelit biakan murni pada NA miring kemudian diinokulasikan S K+ A1 A2 A3 B3 B2 B1 K+ pada media SIM Sulphur Indol Motility selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Media SIM mengandung Pancreatic Digest of Casein, Peptic Digest of Animal Tissue, Ferrous Ammonium Sulfate, Sodium Thiosulfate dan Nutrient Agar. Komposisi media SIM tersebut memungkinkan untuk dilakukan tiga pengujian sekaligus dalam satu media antara lain dapat digunakan pada uji sulfur, uji Indol dan uji motilitas yang akan dibahas pada bagian selanjutnya. Dalam uji sulfur H 2 S, komposisi media SIM yang berperan penting adalah Ferrous Ammonium Sulfate dan Sodium Thiosulfate. Apabila bakteri mampu menghasilkan sulfur maka sulfur tersebut akan berinteraksi dengan Sodium Thiosulfat dan membentuk kompleks Ferrous Thiosulfate berupa logam yang berwarna hitam pada permukaan media SIM. Reaksi pembentukan kompleks tersebut dapat menjadi indikator kemampuan bakteri dalam menghasilkan sulfur sebagai hasil dari proses metabolismenya. Hasil positif terbentuknya sulfur ditunjukkan dengan adanya warna hitam di sepanjang bekas inokulasi sedangkan hasil negatif ditunjukkan dengan tidak adanya endapan hitam atau tidak terdapat warna hitam disepanjang bekas inokulasi Cappucino, 2008. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kontrol positif maupun sampel Pedagang 1 dan Pedagang 2 menunjukkan hasil negatif ditandai dengan tidak adanya warna hitam di sepanjang bekas inokulasi Gambar 11. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kontrol positif E.coli ATCC 25922 maupun sampel yang diuji tidak mampu menghasilkan sulfur H 2 S. Hasil dari uji ini dapat digunakan untuk menegaskan dugaan bahwa bakteri yang terdapat dalam sampel beras kencur dari pedagang 1 maupun 2 adalah E.coli. Hal tersebut diperkuat oleh Holt dkk 2000 yang menyatakan bahwa bakteri E.coli tidak mampu menghasilkan residu sulfur dalam proses peruraian asam amino.

c. Uji Indol

Pada penelitian ini dilakukan uji Indol menggunakan media Sulphur Indol Motility SIM dengan penambahan reagen Kovac. Tujuan dilakukannya uji Indol yaitu untuk melihat pembentukan indol dari asam amino triptofan oleh bakteri dalam sampel jamu beras kencur. Uji Indol dilakukan dengan mengambil satu sengkelit biakan murni kemudian diinokulasikan pada media SIM dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Pembentukan indol dapat diketahui setelah proses inkubasi 24 jam ditandai dengan terbentuknya cincin berwarna merah pada permukaan media setelah ditetesi reagen Kovac. Reagen Kovac mengandung n-Amyl alkohol, HCl dan p-dimethylamin-benzaldehid. Terbentuknya lapisan cincin warna merah pada permukaan media disebabkan oleh pembentukan kompleks indol dengan p- dimethylamin-benzaldehid dari reagen. Menurut Cappucino 2008 kemampuan untuk menghidrolisis triptofan menjadi indol tidak dimiliki oleh semua bakteri. Bakteri tertentu seperti Escherichia coli dapat menghidrolisis triptofan menjadi indol dan asam piruvat melalui kerja enzim triptofanase. Setelah inkubasi 24 jam dan ditetesi reagen Kovac, kontrol positif dan sampel menunjukkan hasil positif ditandai dengan terbentuknya lapisan cincin berwarna merah pada permukaan media Gambar 11. Hasil tersebut menunjukkan bahwa bakteri yang terdapat pada sampel beras kencur maupun kontrol positif mampu menghidrolisis triptofan menjadi indol.

d. Uji Motilitas

Tujuan dilakukannya uji motilitas yaitu untuk mengetahui apakah bakteri yang diidentifikasi merupakan bakteri yang memiliki kemampuan bergerak motil atau tidak. Menurut Radji 2010, E.coli termasuk dalam famili Enterobacteriaceae, berbentuk kokobasil dan mempunyai flagel. Flagel merupakan bulu-bulu cambuk yang dimiliki oleh beberapa jenis bakteria yang memiliki fungsi sebagai alat untuk bergerak. Uji motilitas pada penelitian ini digunakan untuk mengidentifikasi E.coli terhadap bakteri lainnya berdasarkan kemampuan bergerak motil pada media SIM. Kandungan Nutrient Agar semisolid dalam media SIM memungkinkan bakteri yang memiliki flagel melakukan pergerakan dalam media tersebut. Pengujian dilakukan dengan mengambil satu sengkelit biakan murni kemudian diinokulasikan pada media SIM secara tegak lurus dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan bakteri yang menyebar tidak hanya pada bekas tusukan. Hasil uji motilitas dari sampel pedagang 1 maupun pedagang 2 serta kontrol positif menunjukkan adanya pertumbuhan koloni yang menyebar Gambar 11. Holt dkk 2000 menyatakan bahwa E.coli mempunyai flagel di seluruh permukaan sel peritik sebagai alat gerak. Apabila dalam media terdapat pertumbuhan bakteri yang menyebar, maka dinyatakan bakteri yang diidentifikasi tersebut adalah golongan Enterobacter termasuk E.coli. Berdasarkan hasil uji motilitas dapat diketahui bahwa kontrol positif E.coli ATCC 25922 maupun sampel sama-sama memiliki kemampuan bergerak motil. Gambar 11. Hasil uji sulfur, Indol dan motilitas sampel jamu beras kencur pada media SIM Keterangan : uji sulfur - : tidak adanya warna hitam di sepanjang bekas inokulasi pada kontrol positif maupun pada semua sampel : menunjukkan hasil positif uji Indol lapisan berwarna merah yang terdapat pada permukaan media : menunjukkan hasil positif uji motilitas adanya pertumbuhan koloni yang menyebar S : Media SIM sebelum diinkubasi K+ : Kontrol positif biakan murni E.coli ATCC 25922 A1 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 1 A2 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 2 A3 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 3 B1 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 1 B2 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 2 B3 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 3 S K+ A1 A2 A3 B3 B2 B1 K+

e. Uji Metil Merah

Uji metil merah bertujuan untuk mengetahui adanya fermentasi dari asam campuran. Menurut Hadioetomo 1985, sejumlah besar bakteri Gram negatif dapat dikenali berdasarkan produk akhir yang dihasilkannya bila memfermentasi glukosa di dalam medium MR-VP. Bakteri seperti E.coli memfermentasi glukosa dan menghasilkan banyak sekali asam laktat, asetat, suksinat dan format disamping menghasilkan CO 2 , H 2 dan etanol. Akumulasi dari asam-asam yang dihasilkan dapat menurunkan pH menjadi 5,0 atau kurang. Pada uji ini ditambahkan indikator metil merah yang berfungsi menunjukkan adanya perubahan pH yang ditandai dengan perubahan warna media dari kuning pada pH basa menjadi merah apabila dalam kondisi atau pH asam. Hasil positif uji metil merah ditunjukkan dengan adanya perubahan warna media menjadi merah atau merah muda. Pada penelitian ini uji metil merah dilakukan dengan menginokulasikan 1 sengkelit biakan murni kedalam media MR-VP yang mengandung dextrose, pepton dan fosfat, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Kemudian ditambahkan beberapa tetes metil merah setelah proses inkubasi. Kontrol positif maupun sampel Pedagang 1 dan Pedagang 2 menunjukkan hasil positif yaitu berubahnya warna media menjadi merah Gambar 12. Dari hasil uji metil merah yang diperoleh diketahui bahwa bakteri yang ada dalam sampel beras kencur maupun kontrol positif mampu memfermentasikan asam campuran. Gambar 12. Hasil uji metil merah sampel jamu beras kencur Keterangan : KC : Kontrol positif biakan murni E.coli ATCC 25922 A1 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 1 A2 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 2 A3 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 3 B1 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 1 B2 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 2 B3 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 3

f. Uji Voges-Proskauer

Uji Voges-Proskauer dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri yang menghasilkan 2,3-butandiol. Apabila bakteri mampu memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3-butandiol sebagai produk utama maka akan terjadi penumpukan bahan tersebut di dalam media pertumbuhan. Adanya asetoin dalam sampel akan ditunjukkan dengan perubahan warna media dari kuning menjadi merah setelah penambahan KOH 40, kemudian perubahan warna akan diperjelas dengan penambahan larutan α-naftol 5. Uji Voges-Proskauer pada penelitian ini dilakukan dengan menginokulasikan 1 sengkelit biakan murni kedalam media MR-VP kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Setelah inkubasi ditambahkan beberapa tetes KOH dan larutan α-naftol kemudian dikocok sampai homogen dan didiamkan selama 2-4 jam. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna menjadi merah yang menunjukkan bakteri mampu menghasilkan 2,3-butandiol. Setelah dilakukan pengamatan, kontrol positif maupun sampel yang diuji memberikan hasil negatif ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna Gambar 13. Gambar 13. Hasil uji Voges-Proskauer sampel jamu beras kencur Keterangan : KC : Kontrol positif biakan murni E.coli ATCC 25922 A1 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 1 A2 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 2 A3 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 3 B1 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 1 B2 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 2 B3 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 3 Dari hasil tersebut diketahui bahwa bakteri dalam sampel beras kencur dari pedagang 1 dan Pedagang 2 serta kontrol positif tidak menghasilkan produk 2,3- butandiol dalam proses fermentasi melainkan menghasilkan produk berupa asam- asam campuran seperti hasil pada uji metil merah.

g. Uji Sitrat

Pada penelitian ini dilakukan uji sitrat yang bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri yang terdapat dalam sampel beras kencur dalam menggunaan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon yang akan digunakan sebagai energi. Uji sitrat dilakukan dengan menginokulasikan satu sengkelit biakan murni sampel uji maupun kontrol positif ke dalam media Simmon’s Citrate Agar dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Media Simmon’s Citrate Agar merupakan media sintetik dengan NH 4 + sebagai sumber N dan mengandung Brom Thymol Blue sebagai indikator pH. Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon maka asam dari media biakan akan dihilangkan sehingga menyebabkan terjadinya peningkatan pH yang ditandai dengan perubahan warna media dari hijau menjadi biru Cappucino, 2008. Pertumbuhan bakteri yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon pada uji ini dapat dilihat dari adanya kekeruhan dan media yang mengalami perubahan warna. Pembentukan NA karbonat akan menyebabkan perubahan pH menjadi lebih basa. Gambar 14. Hasil uji sitrat sampel jamu beras kencur Keterangan : S : Media Simmon’s Citrate Agar sebelum diinkubasi K+ : Kontrol positif biakan murni E.coli ATCC 25922 A1 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 1 A2 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 2 A3 : Sampel jamu Pedagang 1 replikasi 3 B1 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 1 B2 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 2 B3 : Sampel jamu Pedagang 2 replikasi 3 Setelah inkubasi 24 jam, kontrol positif E.coli ATCC 25922 maupun sampel Pedagang 1 dan Pedagang 2 menunjukkan hasil negatif ditandai dengan tidak adanya perubahan warna media dari hijau menjadi biru serta tidak terlihat kekeruhan pada media Gambar 14. Hal tersebut menunjukkan bahwa kontrol positif maupun bakteri yang tumbuh dalam sampel jamu beras kencur tidak menggunakan sitrat sebagai satu- satunya sumber karbon dan energi. Menurut Sukamto 1999, bakteri E.coli tidak S K+ A1 A2 A3 B3 B2 B1 K+ meggunakan sitrat sebagai sumber karbon melainkan menggunakan asetat. Hasil uji sitrat ini dapat menjadi salah satu uji yang dilakukan untuk mengkonfirmasi atau menegaskan keberadaan bakteri E.coli dalam sampel jamu beras kencur.

h. Pengecatan Gram

Pengecatan Gram bertujuan untuk melihat dan membedakan bentuk maupun sifat dari bakteri Gram positif atau Gram negatif. Menurut Sears 2011, pengecatan Gram merupakan proses pengecatan dengan menggunakan zat warna kristal violet dan zat warna safranin untuk mengetahui morfologi serta sifat dari Gram bakteri berdasarkan karakteristik dinding sel mikroorganisme. Pada penelitian ini pengecatan Gram dilakukan pada sampel jamu beras kencur yang diduga mengandung bakteri E.coli. Larutan A yang terdiri dari zat warna kristal violet yang berfungsi sebagai cat utama, larutan B terdiri dari iodin sebagai penguat cat utama, larutan C yaitu alkohol 70 berfungsi sebagai larutan peluntur dan larutan D merupakan safranin yang berfungsi sebagai cat lawan. Apabila bakteri Gram positif, maka akan berwarna ungu karena bakteri Gram positif akan menyerap zat warna kristal violet ke dalam dinding sel dan mempertahankannya selama pencucian. Sedangkan bakteri Gram negatif tidak dapat mempertahankan zat warna kristal violet pada saat pencucian dan akan berwarna merah setelah pemberian zat warna safranin. Menurut Bruckner 2012, adanya perbedaan warna tersebut disebabkan karena perbedaan struktur dinding sel antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang lebih banyak mengandung peptidoglikan dibandingkan dengan bakteri Gram negatif, sehingga apabila dilakukan penambahan larutan safranin pada bakteri Gram positif tidak menyebabkan perubahan warna menjadi merah karena kompleks violet-iodium tetap terikat pada dinding sel. Bakteri Gram negatif akan kehilangan warna violet karena tercuci oleh alkohol pada tahap pencucian. Selama perlakuan dengan alkohol, lipid akan tertarik ke luar sehingga akan menaikkan permeabilitas dinding sel. Lapisan peptidoglikan yang lebih sedikit serta pori-pori yang cukup besar mengakibatkan kompleks violet-iodine tertarik ke luar sel hingga bakteri kehilangan warna, kemudian saat dilakukan penambahan safranin menyebabkan sel berwarna merah karena kompleks violet-iodium telah larut sehingga mampu mengikat zat warna safranin. Hasil pengecatan Gram pada kontrol positif maupun pada sampel jamu beras kencur Pedagang 1 dan Pedagang 2 menunjukkan warna merah muda dengan bentuk menyerupai batang saat diamati secara mikroskopik dengan perbesaran 1000x Gambar 15. Hal tersebut menunjukkan bahwa bakteri dalam sampel merupakan kelompok bakteri Gram negatif. Menurut Sears 2011, bakteri E.coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk basil menyerupai batang pendek, mempunyai dinding sel yang tipis dan terdapat lapisan bilayer fosfolipid pada bagian luar bakteri yang mengandung lipopolisakarida yang mengelilingi lapisan peptidoglikannya. Hasil pengecatan Gram pada penelitian ini dapat mendukung bukti keberadaan E.coli dalam sampel jamu beras kencur yang diuji. A. Kontrol +