sehingga dapat diketahui ada atau tidaknya keberadaan E.coli dalam jamu beras kencur.
C. Bahan Penelitian
1. Bahan utama yang digunakan yaitu jamu beras kencur yang di jual di Pasar
Sambilegi di wilayah Maguwoharjo Kecamatan Depok Kabupaten Sleman Yogyakarta.
2. Media yang digunakan untuk pengujian ALT adalah Plate Count Agar PCA.
Media selektif E.coli yaitu media E.coli Broth ECB dan media isolasi yang digunakan
yaitu media Tryptone Bile X-Glucuronide TBX. Untuk uji konfirmasi E.coli menggunakan media Sulphur Indol Motility SIM, Methyl-Red Voges
Proskauer MR-VP, Simon’s Citrate Agar SCA. Media untuk uji fermentasi
karbohidrat antara lain larutan gula-gula glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sukrosa.
3. Bakteri baku sebagai standar pembanding atau kontrol positif adalah E.coli
ATCC 25922. 4.
Buffered Peptone Water BPW, aquadest steril, alkohol 70, pereaksi indol,
larutan KOH 40, larutan metil merah, larutan α-naftol.
D. Alat Penelitian
Autoklaf, inkubator, oven, mikroskop, mikropipet, pipet tetes, tabung reaksi dilengkapi tabung Durham, cawan petri, pipet volume, gelas beker, gelas ukur, neraca
analitik, Colony Counter, Erlenmeyer, magnetic stirrer, vortex, jarum ose, Bunsen, plastik steril, botol steril.
E. Tata Cara Penelitian
1. Pemilihan dan Pengambilan Sampel
Sampel jamu yang dipilih adalah jamu beras kencur yang diperoleh dari penjual jamu di Pasar Sambilegi di wilayah Maguwoharjo Kecamatan Depok
Kabupaten Sleman Yogyakarta. Metode sampling yang digunakan dalam penelitian ini adalah Convinience sampling sampling pekoleh. Metode ini
dipilih karena tidak semua populasi dapat diidentifikasi Sedarmayanti, 2011. Sampel diambil dari 3 penjual jamu di pasar Sambilegi. Masing-masing penjual
diambil 1 sampel dengan satu kali pengambilan kemudian diuji dengan melakukan replikasi sebanyak 3 kali pada masing-masing sampel yang diambil.
2. Penanganan Wadah dan Penyiapan Sampel
Sampel yang telah diambil dipindahkan ke dalam botol steril. Pengambilan sampel dari botol steril dilakukan dengan cara membersihkan tutup botol dengan
kapas beralkohol 70 kemudian dibuka secara aseptis di dekat nyala api Bunsen. 3.
Tahap Pra-Pengkayaan
a.
Homogenisasi sampel untuk uji ALT
Secara aseptis diambil sebanyak 25 mL sampel dan dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL kemudian ditambahkan 225 mL Buffered Peptone Water
BPW hingga batas tanda sehingga diperoleh pengenceran 10
-1
.
b.
Pengenceran sampel untuk uji ALT
Pengenceran 10
-1
dari hasil homogenisasi pada penyiapan sampel dipipet sebanyak 1 mL dengan cara aseptis dan dimasukkan ke dalam tabung yang
telah diisi 9 mL BPW hingga diperoleh pengenceran 10
-2
kemudian dihomogenkan menggunakan vortex. Selanjutnya dibuat pengenceran 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
hingga 10
-6
dengan cara yang sama BSN, 2008. 4.
Uji Angka Lempeng Total ALT
a. Pembuatan Media Plate Count Agar PCA
Sebanyak 29 g PCA ditimbang dan dilarutkan dengan 1650 mL aquadest steril, pH diatur 7,0 dan dipanaskan hingga larutan jernih.
Selanjutnya disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121
o
C. b.
Larutan Pengencer Buffered Pepton Water BPW Sebanyak 20 g serbuk BPW dilarutkan dalam 1 L aquadest steril dan
diukur pH 7,0 ± 1. Kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121
o
C. c.
Uji Angka Lempeng Total ALT Masing-masing dari pengenceran dipipet sebanyak 1 mL secara aseptis
ke dalam cawan petri steril dan dibuat duplo. Media PCA sebanyak 15 mL kemudian dituangkan pada setiap cawan petri. Cawan petri digoyangkan
dengan hati-hati agar sampel tersebar merata dengan media dan biarkan hingga memadat. Dilakukan uji kontrol untuk mengetahui sterilitas media dan
pengencer. Uji sterilitas media dilakukan dengan cara menuangkan media PCA ke dalam suatu cawan petri dan dibiarkan memadat. Uji sterilitas
pengencer dilakukan dengan cara menuangkan media PCA dan 1 mL pengencer BPW lalu dibiarkan memadat. Seluruh cawan petri diinkubasi
terbalik pada suhu 35
o
C-37
o
C selama 24 jam hingga 48 jam. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung. Angka Lempeng Total dihitung dalam 1
mL contoh dengan mengkalikan jumlah rata-rata koloni pada cawan dengan faktor pengenceran yang digunakan BSN, 2008.
5. Uji Identifikasi Escherichia coli
a. Uji Pengkayaan dalam media Escherichia coli Broth
Suspensi hasil homogenisasi sampel dipipet sebanyak 1 mL dan diinokulasikan pada 9 mL ECB. Kemudian diinkubasi pada suhu 44
o
C selama 24 jam. Timbulnya gas pada tabung Durham dan kekeruhan pada media
menunjukkan karakteristik E.coli. b.
Isolasi dalam media Tryptone Bile X-Glucuronide TBX Hasil dari biakan pengkayaan diinokulasikan pada permukaan TBX
dengan cara streak plate dan diinkubasi dengan posisi lempeng terbalik pada suhu 35-37
o
C selama 24-48 jam. Koloni spesifik E.coli yang tumbuh dengan ciri-ciri bentuk bulat, diameter 2-3 mm dan berwarna hijau kebiruan dengan
kilap logam.
c. Identifikasi E.coli dengan uji biokimia
Satu koloni spesifik dipilih dari media Tryptone Bile X-Glucuronide TBX
diinokulasikan pada Nutrien Agar NA miring, kemudian diinkubasi pada suhu 35
o
C-37
o
C selama 24 jam. Koloni pada biakan NA miring akan dilanjutkan dengan uji biokimia melalui uji fermentasi karbohidrat, uji Sulfur,
uji Motilitas, uji IMViC Indol, Metil Merah, Voges Proskauker, Sitrat sebagai berikut :
1. Uji fermentasi glukosa
Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada media glukosa dan diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi
kuning Soemarno, 2000. 2.
Uji fermentasi laktosa Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada media laktosa dan
diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange menjadi kuning
. 3.
Uji fermentasi manitol Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada media manitol dan
diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi
kuning.
4. Uji fermentasi maltosa
Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada media maltosa dan diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi
kuning. 5.
Uji fermentasi sukrosa Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada media sukrosa dan
diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange menjadi kuning
6. Uji sulfur
Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada media SIM Sulphur Indol Motility selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Hasil positif terbentuknya sulfur ditunjukkan dengan adanya warna hitam
di sepanjang bekas inokulasi sedangkan hasil negatif ditunjukkan dengan tidak adanya endapan hitam atau tidak terdapat warna hitam disepanjang
bekas inokulasi .
7. Uji motilitas
Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada media SIM selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan bakteri yang menyebar tidak
hanya pada bekas tusukan.
8. Uji Indol
Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada media SIM dan diinkubasikan pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, ditambahkan 1 mL pereaksi indol
Reagen Kovac’s ke dalam masing- masing tabung dan dikocok beberapa menit. Warna merah muda yang
membentuk cincin pada permukaan biakan menunjukkan reaksi indol positif.
9. Uji metil merah
Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada media MR-VP dan diinkubasikan pada suhu 35-37
o
C selama 48 jam. Setelah diinkubasi tambahkan 2 tetes sampai dengan 5 tetes indikator metil merah dan
dikocok homogen selama beberapa menit. Warna kuning menunjukkan hasil reaksi negatif dan warna merah menunjukkan hasil reaksi positif.
10. Uji Voges Proskauer
Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada media MR-VP dan diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 48 jam. Setelah diinkubasi tambahkan 3 tetes larutan alfa naftol dan 2 tetes larutan KOH 40.
Dikocok kemudian didiamkan selama beberapa menit. Jika warna biakan menjadi merah muda hingga merah menyala menunjukkan reaksi positif,
jika warna tidak berubah maka menunjukkan reaksi negatif. 11.
Uji sitrat
Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada media Simmon’s
Citrate Agar lalu diinkubasikan pada suhu 35-37
o
C selama 24-48 jam. Perubahan warna media dari hijau menjadi biru serta adanya kekeruhan
pada perbenihan menunjukkan reaksi positif. d.
Uji konfirmasi keberadaan E.coli dengan pengecatan Gram Sediaan dibuat di atas kaca alas, selanjutnya dikeringkan di udara dan
difiksasikan dengan panas. Sedian diwarnai dengan larutan crystal violet- ammonium oxalate selama 1 menit. Kemudian sediaan dicuci dengan air dan
ditiriskan. Larutan-larutan lugol Gram iodine dibubuhkan selama 1 menit. Selanjutnya sediaan dicuci dengan air dan ditiriskan. Warna dihilangkan
dengan dicuci menggunakan alkohol 95 selama 30 detik. Sediaan dicuci dengan air dan ditiriskan kemudian dibubuhkan larutan safranin selama 10-30
detik. Sediaan dicuci kembali dengan air lalu ditiriskan. Sediaan kemudian diserap dengan kertas saring, dikeringkan dan dilakukan pengamatan dengan
menggunakan mikroskop pada perbesaran 1000 kali SNI, 2008.
F. Analisis Hasil
Kategori