Namun warna spot rafinosa yang dihasilkan sangat tipis. Pada penelitian yang dilakukan oleh Marlis 2007, belum dipublikasikan menunjukkan hal yang
serupa dimana pada kromatografi ekstrak gula tepung umbi jalar sukuh, terdapat tiga buah spot dengan dugaan spot adalah sukrosa, fruktosa, rafinosa
dan oligofruktosa dimana pada warna spot rafinosa dan oligofruktosa sangat tipis. Walaupun dalam jumlah sedikit, keberadaan dari kedua oligosakarida di
dalam ekstrak gula tepung umbi mengindikasikan bahwa umbi garut dan ganyong berpotensi sebagai prebiotik.
D. PENGUJIAN EKSTRAK GULA TEPUNG UMBI UNTUK
MENDUKUNG PERTUMBUHAN BAL
Pengujian pertumbuhan BAL pada ekstrak gula tepung umbi bertujuan untuk menseleksi BAL terbaik dengan tingkat pertumbuhannya yang tinggi.
Dalam pengujian ini, tingkat pertumbuhan BAL diintepretasikan dengan nilai absorbansi. Nilai absorbansi diperoleh dari spektrofotometri dengan panjang
gelombang 600 nm terhadap media pertumbuhan yang terlebih dahulu dipersiapkan. Prinsip pada pengujian dengan metode spektrofotometri
mengacu kepada prinsip turbidimetri. Menurut Harrigan 2000, semakin tinggi kandungan organisme dalam larutan, maka akan menyebabkan semakin
sedikit cahaya yang dapat penetrasi terhadap larutan, dan makin banyak cahaya yang akan terserap oleh larutan tersebut. Dalam metode
spektrofotometri, cahaya yang terserap oleh larutan akan menghasilkan nilai absorbansi tertentu. Nilai absorbansi yang tinggi menunjukkan jumlah sel
yang tinggi pula. Pengujian pertumbuhan dilakukan terhadap 7 jenis BAL yaitu
Bifidobacterium bifidum, B. longum, Lactobacillus casei strain rhamnosus, L.
casei strain shirota, Lactobacillus G1, Lactobacillus F1, Lactobacillus G3
pada media MRS basis steril dengan penambahan ekstrak gula tepung umbi. Selanjutnya dilakukan analisis pertumbuhan BAL guna mencari BAL terbaik.
Setelah didapatkan BAL terbaik, BAL tersebut akan dikompetisikan dengan bakteri patogen.
37
Hasil dari pengujian pertumbuhan BAL pada gula standar, ekstrak gula tepung umbi garut dan ganyong dapat dilihat pada Gambar 14 sampai dengan
Gambar 19 di bawah ini. Pertumbuhan dari BAL uji ditunjukkan dengan nilai positif dari absorbansi yang diukur.
1.232 1.145
1.072
0.367 1.052
0.678 1.009
0.000 0.200
0.400 0.600
0.800 1.000
1.200 1.400
L. casei st rhamnosus
L. casei st shirota
L. G3 B. bifidum
B. longum L. G1
L. F1
A b
so rb
an si
p ad
a λ
= 600n
m
Gambar 14.
Pertumbuhan berbagai jenis BAL uji pada glukosa
0.080 0.050
0.105 0.115
0.040 0.067
0.141 0.000
0.200 0.400
0.600 0.800
1.000 1.200
1.400
L. casei st rhamnosus
L. casei st shirota
L. G3 B. bifidum
B. longum L. G1
L. F1
A b
so rb
a n
si p ad
a λ
= 600n
m
Gambar 15. Pertumbuhan berbagai jenis BAL uji pada inulin
38
0.929 0.982
1.080 0.868
0.726 0.674
0.877
0.000 0.200
0.400 0.600
0.800 1.000
1.200 1.400
L. casei st rhamnosus
L. casei st shirota
L. G3 B. bifidum
B. longum L. G1
L. F1 A
b s
o rb
an si
p a
d a
λ =
60 0n
m
Gambar 16. Pertumbuhan berbagai jenis BAL uji pada rafinosa
0.380 0.288
0.320 0.338
0.330 0.122
0.375
0.000 0.200
0.400 0.600
0.800 1.000
1.200 1.400
L. casei st rhamnosus
L. casei st shirota
L. G3 B. bifidum
B. longum L. G1
L. F1 A
b so
rb an
si p
ad a
λ =
60 0n
m
Gambar 17.
Pertumbuhan berbagai jenis BAL uji pada oligofruktosa
39
0.458 0.353
0.411 0.341
0.274 0.301
0.382
0.000 0.200
0.400 0.600
0.800 1.000
1.200 1.400
L. casei st rhamnosus
L. casei st shirota
L. G3 B. bifidum
B. longum L. G1
L. F1 A
b so
rb an
s i p
ad a
λ =
60 0n
m
Gambar 18. Pertumbuhan berbagai BAL uji pada ekstrak gula tepung umbi garut
segar
0.737 0.568
0.752 0.682
0.506 0.466
0.712
0.000 0.200
0.400 0.600
0.800 1.000
1.200 1.400
L. casei st rhamnosus
L. casei st shirota
L. G3 B. bifidum
B. longum L. G1
L. F1 A
b s
o rb
an si
p a
d a
λ =
600 n
m
Gambar 19. Pertumbuhan berbagai BAL uji pada ekstrak gula tepung umbi
ganyong segar
Dari pengujian pertumbuhan BAL dapat dilihat bahwa hampir keseluruhan BAL uji mempunyai nilai absorbansi yang tinggi pada glukosa dibandingkan
dengan sumber gula lainnya. Hal ini disebabkan, glukosa merupakan gula yang mudah dan siap dimetabolisme oleh BAL. Glukosa bersama dengan
fruktosa merupakan golongan gula monosakarida yang merupakan golongan gula sederhana yang tidak berikatan dengan gugus lainnya dan tidak memiliki
ikatan glikosidik sehingga mudah untuk dimetabolisme oleh BAL. Menurut Lu et al. 2001, glukosa merupakan sumber energi yang lebih disukai
40
dibandingkan dengan fruktosa dan sumber karbon lainnya oleh sebagian besar mikroorganisme.
Dari ketujuh BAL yang digunakan pada uji pertumbuhan BAL, ada satu BAL yang menunjukkan nilai absorbansi yang rendah dengan sumber gula
berupa glukosa, yaitu B. bifidum. Nilai absorbansi yang rendah dapat diakibatkan adanya sel yang lisis akibat pertumbuhan BAL yang
menghasilkan metabolit hasil pertumbuhannya. Menurut Hoover 1999, Bifidobacterium merupakan BAL yang bersifat heterofermentatif dengan
menghasilkan asam laktat dan asam asetat dengan perbandingan asam laktat : asam asetat 3:2. Asam asetat merupakan asam organik yang memiliki
kekuatan merusak sel lebih besar daripada asam laktat. Diduga lisisnya sel disebabkan oleh kandungan asam asetat yang cukup tinggi pada media
pertumbuhan BAL uji hasil dari metabolisme pertumbuhan B. bifidum. Dari hasil pengujian pertumbuhan BAL uji dengan sumber gula berupa
rafinosa, didapatkan bahwa ketujuh BAL uji memiliki nilai absorbansi yang cukup tinggi dibandingkan dengan gula oligosakarida lainnya seperti inulin
dan oligofruktosa. Namun nilai tersebut masih lebih rendah daripada pertumbuhan BAL uji pada gula glukosa. Nilai absorbansi pertumbuhan BAL
pada rafinosa yang cenderung tinggi dibandingkan pada gula oligosakarida lainnya disebabkan rafinosa merupakan gula golongan oligosakarida yang
memiliki struktur yang lebih sederhana dibandingkan oligosakarida lainnya sehingga dapat dicerna dengan lebih baik oleh BAL dan dikenal sebagai salah
satu prebiotik yang dapat menumbuhkan bakteri secara selektif terutama bakteri baik dan menghambat bakteri patogen Manning, 2004.
Dari hasil pengujian pertumbuhan BAL dengan inulin dan oligofruktosa sebagai sumber gula terlihat bahwa pertumbuhan BAL pada kedua gula
tersebut lebih rendah dibandingkan dengan pada rafinosa dan glukosa. Namun nilai absorbansi pertumbuhan BAL pada pertumbuhan di oligofruktosa lebih
tinggi daripada pertumbuhan pada inulin. Perbedaan nilai absorbansi pertumbuhan BAL uji diantara inulin dengan oligofruktosa disebabkan inulin
memiliki struktur yang lebih kompleks dibandingkan dengan oligofruktosa.
41
Menurut Gibson 2000, molekul inulin memiliki nilai DP 10 – 25 dan GFn berkisar antara 2n60 sedangkan oligofruktosa memiliki nilai DP 2 – 7
dan GFn + Fn dengan kisaran 2n7. GFn merupakan susunan molekul unit glucosyl dan fructosyl yang saling berikatan dengan jumlah fructosyl
sebanyak n. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Shin et al. 2000, Inulin dinilai paling tidak efektif dalam menumbuhkan Bifidobacterium Bf-1 dan Bf-
6 diantara sumber karbohidrat uji lainnya. Hal ini disebabkan fermentasi invitro inulin oleh BAL dimana molekul dengan DP 10 terfermentasi hanya
secepat setengah dari kecepatan fermentasi molekul dengan DP 10 Shin et al., 2000. Namun demikian, menurut Franck 2000, oligofruktosa dan inulin
dapat menstimulir pertumbuhan bakteri tertentu terutama bakteri baik dari golongan Bifidobacteria dan menghambat pertumbuhan bakteri patogen,
diantaranya Clostridia. Dari hasil pengujian pertumbuhan BAL uji pada ekstrak gula tepung umbi
garut dan umbi ganyong terlihat bahwa ketujuh BAL uji memiliki nilai absorbansi yang cukup tinggi bila dibandingkan dengan nilai absorbansi pada
inulin dan oligofruktosa. Namun nilai tersebut masih lebih rendah dibandingkan dengan nilai absorbansi pertumbuhan BAL uji pada glukosa dan
rafinosa. Hal tersebut disebabkan pada tahap identifikasi oligosakarida pada ekstrak gula tepung umbi garut dan ganyong memperlihatkan ekstrak gula
tepung umbi garut dan ganyong teridentifikasikan memiliki beberapa kandungan gula yaitu glukosa, fruktosa, sukrosa, rafinosa dan oligofruktosa.
Kandungan gula tersebut mendukung pertumbuhan BAL uji, terutama dari kandungan glukosa, sukrosa dan fruktosa yang tergolong sebagai gula yang
dapat digunakan dengan mudah sebagai sumber gula untuk pertumbuhannya. Sedangkan untuk rafinosa dan oligofruktosa tergolong oligosakarida yang
menyebabkan BAL membutuhkan waktu lebih lama untuk mencernanya sebagai sumber gula tersebut untuk pertumbuhannya.
Dengan membandingkan nilai absorbansi pertumbuhan BAL uji diantara ekstrak gula tepung umbi garut dan ganyong, ekstrak gula tepung umbi
ganyong memiliki nilai absorbansi yang cenderung tinggi dibandingkan dengan ekstrak gula tepung umbi garut. Hal ini disebabkan oleh adanya
42
dugaan konsentrasi gula teridentifikasi terutama sukrosa dan fruktosa pada ekstrak gula tepung umbi ganyong cenderung lebih tinggi dibandingkan
dengan pada umbi garut. Hal ini terlihat pada tahap identifikasi oligosakarida, dimana spot yang dihasilkan dari ekstrak gula tepung umbi ganyong lebih
gelap dibandingkan dengan spot dari ekstrak gula tepung umbi garut. Oleh karena adanya dugaan konsentrasi gula sukrosa, glukosa dan fruktosa lebih
tinggi daripada konsentrasinya dalam ekstrak gula tepung umbi garut, maka ekstrak gula tepung umbi ganyong lebih mudah digunakan sebagai sumber
gula untuk pertumbuhan BAL uji. Dari hasil pengujian pertumbuhan terhadap BAL uji dalam ekstrak gula
tepung umbi garut dan ganyong, terlihat pertumbuhan BAL genus Lactobacillus
memiliki nilai absorbansi lebih tinggi daripada nilai absorbansi dari pertumbuhan BAL genus Bifidobacterium sp. Hal ini disebabkan BAL
genus Lactobacillus cenderung lebih mudah dan cepat menggunakan gula- gula sederhana yang terdapat pada ekstrak gula tepung umbi garut daripada
BAL genus Bifidobacterium sp. Hal ini disebabkan BAL uji genus Lactobacillus
yang mempunyai nilai absorbansi pertumbuhan BAL pada ekstrak gula tepung umbi terbesar tergolong dalam BAL homofermentatif
sedangkan BAL genus Bifidobacterium tergolong BAL heterofermentatif. Menurut Hoover 1999, metabolisme BAL heterofermentatif memiliki
kompleksitas yang lebih tinggi daripada BAL homofermentatif. BAL genus Lactobacillus yang memiliki nilai absorbansi pertumbuhan
BAL pada ekstrak gula tepung umbi terbesar dimiliki oleh Lactobacillus casei strain rhamnosus dan Lactobacillus G3. Keduanya memiliki nilai absorbansi
pertumbuhan BAL pada ekstrak gula tepung umbi garut dan ganyong yang lebih tinggi dibandingkan kelima BAL uji lainnya. Hal ini ditunjukkan dengan
nilai absorbansi pertumbuhan BAL pada ekstrak gula tepung umbi garut masing-masing adalah sebesar 0.458 untuk L.casei strain rhamnosus dan 0.411
untuk Lactobacillus G3, dan pada ekstrak gula tepung umbi ganyong adalah sebesar 0.752 untuk Lactobacillus G3 dan 0.737 untuk L.casei strain
rhamnosus. Sedangkan BAL uji lainnya hanya memiliki nilai absorbansi pertumbuhan BAL pada ekstrak gula tepung umbi masing-masing sebesar
43
0.400 pada ekstrak gula tepung umbi garut dan 0.720 pada ekstrak gula tepung umbi ganyong.
Pemilihan BAL terbaik dilakukan dengan memilih satu dari masing- masing genus BAL yang berbeda, untuk BAL genus Lactobacillus dipilih
Lactobacillus G3 dengan pertimbangan bahwa Lactobacillus G3 merupakan
isolat BAL klinis lokal sehingga dapat meningkatkan nilai fungsi dari isolat BAL klinis lokal itu sendiri. Selain itu, Lactobacillus G3 memiliki nilai
absorbansi pertumbuhan BAL pada ekstrak gula tepung umbi yang tidak berbeda terlalu jauh dengan tingkat pertumbuhan L.casei strain rhamnosus.
Untuk BAL genus Bifidobacterium dipilih B. bifidum dengan nilai absorbansi sebesar 0.341 pada ekstrak gula tepung umbi garut dan sebesar 0.682 pada
ekstrak gula tepung umbi ganyong dimana keduanya merupakan nilai absorbansi pertumbuhan BAL pada ekstrak gula tepung umbi tertinggi
dibandingkan dengan BAL sesama genus yaitu B. longum yang hanya memiliki nilai absorbansi pertumbuhan BAL pada ekstrak gula tepung umbi
masing-masing adalah sebesar 0.274 pada ekstrak gula tepung umbi garut dan sebesar 0.506 pada ekstrak gula tepung umbi ganyong. Selanjutnya kedua
BAL terbaik ini akan digunakan pada pengujian kompetisi BAL melawan patogen.
E. KOMPETISI BAL TERBAIK DENGAN PATOGEN PADA EKSTRAK
