Bahan untuk penapisan fitokimia adalah ammonia 10, 25, kloroform, HCL 1, 1:10, pereaksi Dragendorff, pereaksi Mayer, aquadest,
lempeng magnesium, HCL pekat, butanol, larutan besi III klorida FeCl
3
1, pereaksi Stiasny, NaOH 1 N, eter, asam asetat anhidrat, H
2
SO
4
pekat, pereaksi Libermann-Burchard, petroleum eter.
Bahan untuk pembuatan tablet hisap
Ekstrak kering daun sirih, kapur sirih CaCO
3
, sukrosa, manitol, avicel, laktosa, mg stearat, talk, vanilla.
Bahan untuk uji CD4
Reagen BD Tritest CD4, BD FACS lysing solution.
4.3 Prosedur Penelitian
4.3.1 Pemeriksaan Simplisia Determinasi
Simplisia yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih Piper betle L. yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat
Aromatik BALITRO, Bogor. Sebelum dilakukan penelitian terhadap tumbuhan, terlebih dahulu dilakukan determinasi untuk mengidentifikasi
jenis dan memastikan kebenaran simplisia. Determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense, Puslit Biologi Bidang Botani LIPI Cibinong.
4.3.2 Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Sirih
Daun sirih segar dibersihkan dari kotoran yang melekat. Daun sirih tersebut dicuci dengan air mangalir dan terakhir dibilas. Setelah itu daun
sirih dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Daun yang telah kering
dihaluskan dengan blender dan disaring dengan ayakan sehingga diperoleh simplisia dalam bentuk serbuk.
4.3.3 Penapisan Fitokimia
Serbuk diperiksa secara organoleptis dan dilakukan uji penapisan fitokimia. Uji penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui ada
tidaknya kandungan alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, kuinon, steroid dan triterpenoid, minyak atsiri dan kumarin.
Prosedur masing-masing pengujian adalah sebagai berikut : a.
Identifikasi golongan alkaloid Sebanyak 2 gram serbuk ditambahkan dengan 5 ml ammonia
25, digerus dalam mortir, kemudian ditambahkan 20 ml etil asetat dan digerus kembali dengan kuat, campuran tersebut disaring dengan
kertas saring. Filtrat berupa larutan organik diambil sebagai larutan A, sebagian dari larutan A 10 ml diekstraksi dengan 10 ml larutan
HCl 1:10 dengan pengocokan dalam tabung reaksi, diambil larutan bagian atasnya larutan B. Larutan A diteteskan beberapa tetes pada
kertas saring dan ditetesi dengan pereaksi Dragendorff. Jika terbentuk warna merah atau jingga pada kertas saring maka hal itu menunjukkan
adanya senyawa golongan alkaloid dalam sampel. Larutan B dibagi dalam dua tabung reaksi, ditambahkan masing-masing pereaksi
Dragendorff dan pereaksi Mayer. Jika terbentuk endapan merah bata dengan pereaksi Dragendorff dan endapan putih dengan pereaksi
Mayer maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid.
b. Identifikasi golongan flavonoid
Sebanyak 1 gram serbuk ditambahkan 50 ml air panas, dididihkan selama 5 menit, disaring dengan kertas saring, diperoleh
filtrat yang akan digunakan sebagai larutan percobaan. Ke dalam 5 ml larutan percobaan dalam tabung reaksi ditambahkan serbuk atau
lempeng magnesium secukupnya dan 1 ml HCl pekat, serta 5 ml butanol, dikocok dengan kuat lalu dibiarkan hingga memisah. Jika
terbentuk warna pada lapisan butanol lapisan atas maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan flavonoid.
c. Identifikasi golongan saponin
Sebanyak 10 ml larutan percobaan yang diperoleh dari percobaan b identifikasi golongan flavonoid, dimasukkan ke dalam tabung
reaksi dan dikocok secara vertikal selama 10 detik, kemudian dibiarkan selama 10 menit. Jika dalam tabung reaksi terbentuk busa
yang stabil dan jika ditambahkan 1 tetes HCl 1 busa tetap stabil maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan saponin.
d. Identifikasi golongan tanin
Sebanyak 2 gram serbuk ditambahkan 100 ml air, dididihkan selama 15 menit lalu didinginkan dan disaring dengan kertas saring,
filtrat yang diperoleh dibagi menjadi dua bagian. Ke dalam filtrat pertama ditambahkan 10 ml larutan FeCl
3
1, jika terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman maka hal itu menunjukkan adanya
senyawa golongan tanin.
Ke dalam filtrat yang kedua ditambahkan 15 ml pereaksi Stiasny formaldehid 30 : HCl pekat = 2 : 1, lalu dipanaskan di atas
penangas air sambil digoyang-goyangkan. Jika terbentuk endapan warna merah muda menunjukkan adanya tanin katekuat. Selanjutnya
endapan disaring, filtrat dijenuhkan dengan serbuk natrium asetat, ditambahkan beberapa tetes larutan FeCl
3
1, jika terbentuk warna biru tinta maka menunjukkan adanya tanin galat.
e. Identifikasi golongan kuinon
Diambil 5 ml larutan percobaan dari percobaan b identifikasi golongan flavonoid, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
ditambahkan beberapa tetes larutan NaOH 1 N. Jika terbentuk warna merah maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan kuinon.
f. Identifikasi golongan steroid dan triterpenoid
Sebanyak 1 gram serbuk ditambahkan dengan 20 ml eter, dibiarkan selama 2 jam dalam wadah dengan penutup rapat lalu
disaring dan diambil filtratnya. 5 ml dari filtrat tersebut diuapkan dalam cawan penguap hingga diperoleh residusisa. Ke dalam residu
ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Libermann-Burchard. Jika terbentuk warna hijau atau
merah maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan steroid dan triterpenoid dalam simplisia tersebut.
g. Identifikasi golongan minyak atsiri
Sebanyak 2 gram serbuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi volume 20 ml, ditambahkan 10 ml pelarut petroleum eter dan
dipasang corong yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi dengan air pada mulut tabung, dipanaskan selama 10 menit di atas
penangas air dan didinginkan lalu disaring dengan kertas saring. Filtrat yang diperoleh diuapkan dalam cawan penguap hingga
diperoleh residu. Residu dilarutkan dengan pelarut alkohol sebanyak 5 ml lalu disaring dengan kertas saring. Filtratnya diuapkan dalam
cawan penguap, jika residu berbau aromatikmenyenangkan maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan minyak atsiri.
h. Identifikasi golongan kumarin Sebanyak 2 gram serbuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi
volume 20 ml, ditambahkan 10 ml pelarut kloroform dan dipasang corong yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi dengan air
pada mulut tabung, dipanaskan selama 10 menit di atas penangas air dan didinginkan lalu disaring dengan kertas saring. Filtrat yang
diperoleh diuapkan dalam cawan penguap hingga diperoleh residu. Residu ditambahkan air panas sebanyak 10 ml lalu didinginkan.
Larutan tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 0,5 ml larutan ammonia NH
4
OH 10. Lalu diamati di bawah sinar lampu ultraviolet pada panjang gelombang 365 nm. Jika terjadi
fluoresensi warna biru atau hijau maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan kumarin.
4.3.4 Pembuatan Ekstrak Kental
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan metode maserasi. Serbuk simplisia dari daun sirih dimaserasi dengan pelarut etanol 70 dan
dilakukan pengocokan sesekali, kemudian diendapkan selama 48 jam, lalu disaring, sehingga diperoleh filtrat ke-1 dan ampas. Kemudian ampas
dilarutkan kembali dengan pelarut etanol 70, dilakukan pengocokan sesekali kemudian didiamkan selama 48 jam dan disaring, diperoleh filtrat
ke-2 dan ampas. Perlakuan tersebut dilakukan hingga filtrat berwarna beningjernih. Lalu semua filtrat digabung, dan diuapkan atau dipekatkan
dengan rotary evaporator pada suhu 40-50°C hingga diperoleh ekstrak kental. Dihitung hasil rendemen ekstrak hasil perolehan kembali dengan
rumus : Bobot ekstrak yang didapat
Rendemen = x 100
Bobot serbuk simplisia yang diekstraksi
4.3.5 Karakterisasi Ekstrak
a. Parameter Spesifik
1. Identitas
Memberikan identitas obyektif dari nama dan spesifik dari senyawa identitas dengan cara melihat kandungan dari ekstrak yang
dibuat Anonim, 2000. 2. Organoleptik
Mengamati bentuk, warna, bau dan rasa dari ekstrak yang dibuat Anonim, 2000.
b. Parameter Non Spesifik
1. Susut pengeringan Ekstrak ditimbang secara seksama sebanyak 1 gram sampai 2
gram dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105
o
C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang, ekstrak diratakan dalam botol
timbang, dengan menggoyangkan botol, hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm. kemudian dimasukkan ke
dalam oven, dibuka tutupnya, dikeringkan pada suhu 105
o
C hingga bobot tetap. Biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam
eksikator hingga suhu kamar. Timbang kembali bobot setelah pengeringan Anonim, 2000; Anonim, 1994.
Susut pengeringan = Berat awal-Berat akhir x 100 Berat awal
2. Kadar lembab Ditimbang 1 gram ekstrak pada alumunium foil yang telah
ditara. Kemudian dimasukkan ke dalam alat moisture balance. Alat dihidupkan. Kemudian kadar lembab yang terukur dicatat Anonim,
2000; Anonim, 1994.
3. Kadar abu Kurang lebih 2 gram sampai 3 gram ekstrak ditimbang dan
dimasukkan ke dalam krus yang telah dipijarkan dan ditara. Kemudian dimasukkan ke dalam furnace dan dipijarkan hingga bobot tetap.
Sampel diangkat, didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas
lalu saring dengan kertas saring bebas abu. Pijarkan residu dan kertas dalam krus yang sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan,
pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Anonim, 2000; Anonim,
1994. Kadar abu = 1 – A – B x 100
C Dimana : A = Berat ekstrak + wadah awal gram
B = Berat ekstrak + wadah akhir gram C = Berat ekstrak gram
4.3.6 Pembuatan Ekstrak Kering
Ekstrak kental yang diperoleh ditambahkan dengan avicel pH 102 dengan perbandingan terhadap ekstrak 1,72 : 1. Setelah kering kemudian
ekstrak tersebut digerus dalam lumpang hingga diperoleh serbuk kering ekstrak.
