3.2.2 Pengujian Aktivitas Antimikroba BAL
Pada penelitian ini, metode yang digunakan untuk mengetahui BAL probiotik terbaik dalam bentuk yogurt sinbiotik adalah metode kontak. Metode ini didasarkan pada sifat antimikroba dari BAL
probiotik lokal L. plantarum 2C12 danatau L. fermentum 2B4 dalam yogurt terhadap bakteri Enteropathogenic Escherichia coli
EPEC yang dapat menyebabkan diare dan melihat penurunan jumlah bakteri EPEC setelah dikontakkan dengan yogurt.
Sebanyak 0.1 mL 1 kultur bakteri patogen dimasukkan dalam 10 mL produk. Untuk mengetahui jumlah bakteri patogen awal jam ke-0, dilakukan pemupukan dengan media spesifik
pada tingkat pengenceran produk 10
-6
, 10
-7
dan 10
-8
kemudian dilakukan inkubasi pada suhu 37
o
C selama 24-48 jam. Media agar yang digunakan untuk Escherichia coli adalah EMBA.
Untuk mengetahui jumlah bakteri EPEC 1 awal, dilakukan pemupukan pada media EMBA Eosin Methylene Blue Agar kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Sementara itu, untuk mengetahui seberapa besar penghambatan formula yogurt, bakteri EPEC 1 dikontakkan
dengan masing-masing formula yogurt selama dua, empat, dan enam jam. Penentuan lama waktu kontak tersebut didasarkan pada kurva pertumbuhan EPEC di mana waktu dua, empat, dan enam jam
tersebut merupakan waktu bakteri E. coli berada pada fase log Quigley 2008.
Setelah itu, jumlah bakteri EPEC akhir dapat diketahui dengan melakukan pemupukan pada jam ke-2, jam ke-4, dan jam ke-6 pada media EMBA, kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Lalu, dilihat bagaimana efek penghambatan masing-masing formula yogurt tersebut terhadap
EPEC yang ditunjukkan dengan penurunan jumlah bakteri EPEC dengan mengurangi jumlah EPEC awal dengan EPEC akhir. Selanjutnya, yogurt yang memberikan nilai penghambatan tertinggi
merupakan yogurt formula terbaik yang kemudian dioptimasikan agar menjadi produk yang siap dipasarkan.
3.3 Penelitian Utama: Analisis Yogurt Sinbiotik secara In Vivo
Pada penelitian utama ini, formula terbaik dari empat formula yogurt sinbiotik yang diuji secara in vitro pada penelitian pendahuluan, diuji pada tikus percobaan yang diinjeksi dengan EPEC
untuk diketahui efek imunomodulator dan antidiarenya.
3.3.1 Pengelolaan Hewan Percobaan
3.3.1.1 Hewan percobaan
Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih Albino Norway Rats Rattus novergicus
galur Sprague Dawley yang berumur 5-6 minggu dan berjenis kelamin jantan hasil perkembangbiakan Pusat Studi Biofarmaka
–LPPM IPB. Tikus percobaan yang digunakan untuk penelitian ini berjumlah 70 ekor dengan kisaran berat badan awal 80
–100 gr.
3.3.1.2 Kandang dan perlengkapan
Kandang hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang yang berukuran 17,5 x 23,75 x 17,5 cm dan berjumlah 70 buah sesuai dengan jumlah tikus yang digunakan
Gambar 5. Kandang tikus berlokasi pada tempat atau ruangan yang bebas dari suara ribut dan terjaga dari asap industri dan polutan lainnya. Ruangan tempat kandang tikus berada mudah dibersihkan dan
disanitasi dengan suhu optimum ruangan untuk tikus adalah 22-24°C, kelembapan udara 50-60, dan ventilasi yang cukup, namun tidak ada jendela yang terbuka Faith dan Hessler 2006.
Gambar 5. Kandang tikus percobaan
3.3.1.3 Ransum
Komposisi ransum basal disusun berdasarkan standar AOAC yaitu mengandung karbohidrat, protein, lemak, mineral, vitamin, dan air.
Berikut adalah komposisi sumber dan jumlah ransum untuk tikus percobaan: Tabel 3. Komposisi ransum basal basis 1000 gr
Sumber : AOAC 1990
3.3.1.4 Perlakuan terhadap hewan percobaan
Tikus percobaan yang berjumlah 70 ekor akan dibagi menjadi 5 kelompok. Setiap kelompok terdiri atas 15 ekor tikus sebagai ulangan, kecuali kelompok yogurt prebiotik konvensional hanya
terdiri atas 5 ekor tikus. Sebelum pemberian perlakuan, dilakukan adaptasi tikus terhadap lingkungan selama tiga hari dengan pemberian makan ransum basal terhadap semua tikus.
Adapun pembagian kelompok tikus terdiri atas kelompok kontrol negatif, kontrol positif, yogurt sinbiotik, yogurt prebiotik konvensional, yogurt sinbiotik + EPEC. Pada Tabel 4 dijelaskan
perlakuan dari masing-masing kelompok tikus percobaan. Adapun kelompok yogurt prebiotik konvensional hanya terdiri dari BAL L. bulgaricus dan S. thermophilus bukan probiotik dan FOS 5
. Yogurt dengan BAL L. bulgaricus dan S. thermophilus saja adalah sama dengan jenis yogurt komersial yang umum dijual di pasaran. Adanya kelompok ini berfungsi sebagai pembanding untuk
melihat apakah yogurt komersial sudah cukup untuk menjaga saluran pencernaan atau tidak.
Komponen Sumber
Perhitungan Jumlah gr
Protein Kasein N=6.38
118.70
Lemak
Minyak jagung 78.70
Mineral
Mineral mix 47.9
Vitamin
Vitamin mix Vitkom 1
10
Serat Carboxymethylcellulose
1 10
Air
Air 36.2
Pati Pati jagung
100 – lainnya
698.5
Tabel 4. Kelompok tikus percobaan berdasarkan perlakuan yang diberikan
Pengujian perlakuan anti EPEC secara in vivo dilakukan sesuai petunjuk Zoumpopoulou et al. 2008 hanya berbeda bakteri patogen yang digunakan. Yogurt sinbiotik formula terbaik adalah yogurt
sinbiotik dari hasil penelitian pendahuluan. Yogurt diberikan secara oral sebanyak 1 mLhari dengan populasi BAL sebanyak 10
9
cfumL menggunakan sonde mulai hari ke-1 sampai hari ke-21. Infeksi EPEC penyebab diare dilakukan dengan populasi 10
7
cfumL sebanyak 1 mLhari selama 7 hari hari ke-8 sampai hari ke-14 secara oral menggunakan sonde Gambar 6. Berdasarkan Oyetayo 2004,
bahwa dosis infeksi EPEC adalah minimal 10
5
cfumL.
Gambar 6. Pemberian air minum, yogurt dan EPEC menggunakan sonde Bobot badan tikus ditimbang setiap dua hari sekali. Sementara itu, pakan yang diberikan dan
sisanya ditimbang setiap hari Setelah perlakuan tertentu selesai diaplikasikan pada tikus percobaan, dilakukan proses terminasi seperti terlihat pada Gambar 7.
Kelompok Tikus Perlakuan
Kontrol negatif
Tikus normal yang hanya diberi ransum standar dan akuades
Kontrol positif
Tikus yang diberi ransum standar dan infeksi EPEC
Yogurt sinbiotik
Tikus yang diberi ransum standar diiringi pemberian yogurt sinbiotik formula terbaik
Yogurt sinbiotik + EPEC Tikus yang diberi ransum standar, diiringi
pemberian yogurt sinbiotik formula terbaik dan diselingi dengan pemberian EPEC
Yogurt prebiotik konvensional
Tikus yang diberi ransum standar diiringi pemberian yogurt prebiotik konvensional
Keterangan: T0 = terminasi awal 5 ekor tikus
T1 = terminasi hari ke-7 5 ekor tikus setiap kelompok T2 = terminasi hari ke-14 5 ekor tikus setiap kelompok
T3 = terminasi hari ke-21 5 ekor tikus setiap kelompok Proses pengambilan darah dilakukan dengan metode dislokasi cervical pada intra cardiaca atau
daerah jantung Gambar 8.
Gambar 8. Metode terminasi dan proses pengambilan darah tikus percobaan Tikus didislokasi leher untuk membunuh tikus tanpa memecah pembuluh darahnya. Dislokasi
dilakukan dengan memegang bagian leher tikus dan bagian belakang dekat ekor dan menariknya sampai tikus mati. Tikus diletakkan secara terlentang diatas papan untuk memudahkan pembedahan.
Pengambilan darah dari intra cardiacajantung dilakukan dengan anestesi terlebih dahulu. Pertama, ekor dipegang di daerah sepertiga pangkal ekor kemudian jari telunjuk dan ibu jari tangan lain
memegang kuduk, jari kelingking menjepit ekor sebaiknya dengan tangan kiri hingga persendiannya terpisah. Kemudian darah diambil dari jantung secara cepat dan hati-hati agar tidak terjadi hemolisis
lalu dimasukkan ke dalam tabung yang sudah berisi ethylenediaminetetraacetic acid EDTA.
3.3.2 Analisis Hematologi
Analisis kondisi hematologik dilakukan sesuai Aboderin dan Oyetayo 2006. Analisis kondisi hematologik dilakukan sebagai alat diagnosa kesehatan tubuh dan parameter status imun darah.
Prosedur analisanya sebagai berikut : sampel darah tikus dikoleksi dari tikus melalui cardiac puncture ke dalam botol EDTA.
Analisis dilakukan dengan menggunakan alat otomatik hematology analyzer dengan parameter jumlah trombosit, kadar hemoglobin Hb, jumlah leukosit white blood cellWBC, jumlah eritrosit
red blood cellRBC, dan nilai hematokrit. Gambar 7. Bagan perlakuan proses terminasi tikus percobaan
H-3 Adaptasi
T0
Cekok EPEC 10
7
H0 H7
H14 H21
T1 T2
T3
3.3.3 Rancangan Percobaan
Rancangan penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap, dengan model matematika sebagai berikut :
Yij = µ + αi + j + εij, dimana Yij = pengaruh perlakuan pada tikus kelompok tikus ke
–i dan ulangan ke-j µ = nilai tengah perlakuan
αi = pengaruh perlakuan ke-i j = pengaruh ulangan ke-j
εi = galat perlakuan ke-I dan ulangan ke-j Data dianalisis dengan menggunakan ANOVA. Jika terdapat perbedaan nyata akan diuji lanjut
dengan uji Duncan Steel dan Torrie 1995.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penentuan Formula Yogurt Sinbiotik Terpilih