Isolasi, Seleksi, dan Uji Aktivitas Antimikroba Kapang Endofit dari Daun Tanaman Jamblang (Syzygium cumini L.) terhadap Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans dan Aspergillus niger.

ISOLASI, SELEKSI, DAN UJI AKTIVITAS

ANTIMIKROBA KAPANG ENDOFIT DARI DAUN

TANAMAN JAMBLANG (Syzygium cumini L.)

TERHADAP Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans,

dan Aspergillus niger

SKRIPSI

PUTRI NUR HANDAYANI

NIM. 1111102000104

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

JAKARTA

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI, SELEKSI, DAN UJI AKTIVITAS

ANTIMIKROBA KAPANG ENDOFIT DARI DAUN

TANAMAN JAMBLANG (Syzygium cumini L.)

TERHADAP Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans

dan Aspergillus niger

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

PUTRI NUR HANDAYANI

NIM. 1111102000104

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

JAKARTA

vi ABSTRAK

Nama : Putri Nur Handayani Program Studi : Farmasi

Judul : Isolasi, Seleksi, dan Uji Aktivitas Antimikroba Kapang Endofit dari Daun Tanaman Jamblang (Syzygium cumini L.) terhadap Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans dan Aspergillus niger.

Kapang endofit adalah kapang yang hidup pada jaringan tanaman dan tidak membahayakan inangnya. Kapang endofit dapat menghasilkan senyawa bioaktif sebagai senyawa metabolit sekunder yang memiliki daya antimikroba, antimalaria, antikanker, anti-HIV, antioksidan dan sebagainya. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, menyeleksi dan menguji aktivitas antimikroba isolat kapang endofit yang diisolasi dari daun tanaman Syzygium cumini L. terhadap Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans dan Aspergillus niger. Kapang endofit berhasil diisolasi dari daun jamblang (Syzygium cumini L), sebanyak 14 isolat, yaitu terdiri dari 6 isolat kapang endofit dari daun tuan (DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, dan DT6) dan 8 isolat kapang endofit dari daun muda (DM1, DM2, DM3, DM4, DM5, DM6, DM7, dan DM8). Keempat belas isolat ini diseleksi lebih lanjut potensi antimikrobanya dengan menggunakan metode difusi agar untuk aktivitas antibakteri dan antikhamir dan metode uji antagonis untuk aktivitas antifungi. Hasil seleksi isolat kapang endofit yang berpotensi antimikroba sebanyak 11 isolat (DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, DM2, DM3, DM4, DM5, DM6, dan DM8). Kesebelas isolat tersebut difermentasi pada media Potato Dextrose Yeast Broth selama 14 hari dengan kondisi statis dan diuji aktivitas antimikrobanya. Metode yang digunakan untuk uji antimikroba adalah metode Kirby-Bauer atau yang lebih dikenal dengan sebutan metode cakram kertas. Aktivitas antimikroba isolat kapang endofit dapat dilihat dari zona hambat yang terbentuk pada koloni isolat. Hasil uji aktivitas antimikroba dari supernatan hasil fermentasi isolat kapang endofit selama 14 hari didapatkan 10 isolat yang aktif terhadap Escherichia coli (DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, DM2, DM3, DM4, DM5, dan DM6), 5 isolat yang aktif terhadap Staphylococcus aureus (DT1, DT2, DT3, DM2, dan DM5). 5 isolat yang aktif terhadap Bacillus subtillis (DT1, DT2, DT3, DT4, dan DT5), 2 isolat yang aktif terhadap Aspergillus niger (DM6 dan DM8), dan tidak ada isolat yang aktif terhadap Pseudomonas aeruginosa maupun Candida albicans.

Kata kunci : Jamblang, Syzygium cumini L, kapang endofit, aktivitas antimikroba, metode difusi agar, metode uji antagonis, metode Kirby-Bauer.

vii ABSTRACT

Name : Putri Nur Handayani Study Program: Pharmacy

Title : Isolation, Selection, and Antimicrobial Activity of Endophytic Fungus from Jamblang Leaf Plants (Syzygium cumini L.) Against Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans dan Aspergillus niger.

Endophytic fungi are fungi that live on plant tissue and does not harm its host. Endophytic fungi can produce bioactive compounds as secondary metabolites that have antimicrobial, anti-malarial, anti-cancer, anti-HIV, antioxidants and etc. This study aims to isolate, select and test the antimicrobial activity of endophytic fungi isolates that isolated from leaves of Syzygium cumini L. against Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans and Aspergillus niger. The result of endophytic fungi isolation in these experiments showed a total of 14 isolates, which consists of 6 isolates of endophytic fungi of dark green leaves (DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, and DT6) and 8 isolates of endophytic fungi of light green leaves (DM1, DM2, DM3, DM4, DM5, DM6, DM7 and DM8). Furthermore, that fourteenth isolates were selected antimicrobial potential with using the agar diffusion method for antibacterial activity and antikhamir activity and using antagonist test method for antifungal activity. The selection results of antimicrobial potential of endophytic fungi isolates were 11 isolates (DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, DM2, DM3, DM4, DM5, DM6, and DM8). The eleven isolates were fermented in medium Potato Dextrose Yeast Broth for 14 days with a static condition and tested antimicrobial activity. The method used to test the antimicrobial is Kirby-Bauer method, or better known as paper disc method. The antimicrobial activity of endophytic fungi isolates can be seen from the inhibition zone formed in the colony isolates. The results on the antimicrobial activity of the supernatant of endophytic fungi isolates fermented for 14 days showed 10 isolates were active against Escherichia coli (DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, DM2, DM3, DM4, DM5, dan DM6), 5 isolates were active against Staphylococcus aureus (DT1, DT2, DT3, DM2, dan DM5), 5 isolates were active against Bacillus subtillis (DT1, DT2, DT3, DT4, dan DT5), 2 isolates were active against Aspergillus niger (DM6 dan DM8), none of the isolates active against Pseudomonas saeruginosa and Candida albicans.

Keywords: Jamblang, Syzygium cumini L, endophytic fungi, antimicrobial activity, agar diffusion method, antagonist test method, Kirby-Bauer method

viii

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmannirrahim

Alhamdulillahirabbil’alamin, puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan anugrah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi yang berjudul “Isolasi, Seleksi, dan Uji Aktivitas Antimikroba Kapang Endofit dari Daun Tanaman Jamblang (Syzygium cumini L.) terhadap Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans dan Aspergillus niger”. Shalawat serta salam semoga senantiasa tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW beserta para keluarga dan sahabatnya. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar sarjana farmasi di Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, penyusunan skripsi ini akan terasa sulit. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Ibu Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Sc., Apt selaku pembimbing pertama dan Ibu Eka Putri, M.Si., Apt selaku pembimbing kedua, yang senantiasa memberi arahan, dukungan, semangat, saran, dan solusi dalam proses penelitian dan penyelesaian skripsi ini. Semoga segala bantuan dan bimbingannya mendapat imbalan yang lebih baik di sisi-Nya.

2. Ibu Puteri Amelia, M.Farm., Apt. dan Ibu Ismiarni Komala, Ph.D., Apt selaku dosen penguji yang telah memberikan sumbangan pikiran, saran, dan masukan kepada penulis.

3. Bapak Dr. H. Arif Sumantri, SKM., M. Kes, selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak Yardi, Ph.D., Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Bapak Saiful Bahri, M.Si atas diskusi dan masukan selama penelitian ini. 6. Ibu/Bapak Dosen dan Staf Akademika Program Studi Farmasi UIN Syarif

ix

7. Ayahanda Saman dan Ibunda Nuraidah yang tiada hentinya memberikan doa, dukungan dan kasih sayang yang tiada terhingga kepada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.

8. Kakak-kakakku tercinta yang telah memberi motivasi dan dukungannya kepada penulis.

9. Para laboran di FKIK (Kak Rani, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Tiwi, dan Kak Rachmadi) yang telah banyak membantu selama proses penelitian.

10.Teman-teman seperjuangan mikrobiologi (Arini, Ambar, Ati, Brasti, Rahma, Karimah, Sumiati, Dila, Meri, Bachtiar, Adit, Mozer, Fitri, dan Syaima) yang menemani dan mengisi hari-hari waktu penelitian menjadi menyenangkan. 11.Sahabat-sahabat tercinta (Arini, Sheila, Meryza, dan Athiyah) yang senantiasa

menjadi penyemangat, motivator, dan tempat berbagi suka dan duka kepada penulis.

12.Pihak-pihak lain yang tidak dapat ditulis satu persatu yang turut membantu menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu saran, kritik, dan masukan sangat diharapkan demi penyempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini bermanfaat dan dapat menjadi sumbangan pengetahuan bagi para pembacanya.

Jakarta, 6 Juli 2015

xi DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ……….. ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS………..……... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ………...……….. iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI…….………...………... v

ABSTRAK ……….………...………...………... vi

ABSTRACT ……….………...………...……..……... vii

KATA PENGANTAR ………...……….... viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSTUJUAN PUBLIKASI ....………... x

DAFTAR ISI ……….. xi

DAFTAR GAMBAR……….. xiii

DAFTAR TABEL………... xv

DAFTAR LAMPIRAN……….. xvi

BAB 1. PENDAHULUAN ………..... 1

1.1 Latar Belakang …………..………..…..……… 1

1.2 Rumusan Masalah ………..……..…. 3

1.3 Tujuan Penelitian ………...… 3

1.4 Manfaat Penelitian ……….………... 4

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ………... 5

2.1 Kapang Endofit ……….... 5

2.1.1 Interaksi Kapang Endofit dengan Tanaman ……….... 6

2.1.2 Kapang Endofit Penghasil Antimikroba ….………... 6

2.1.3 Isolasi Kapang Endofit ……….…………... 7

2.2 Antimikroba ……….. 7

2.2.1 Mekanisme Antimikroba ….……….... 8

2.2.2 Penentuan Aktivitas Antimikroba ………...…………. 9

2.3 Mikroba Uji ……..………... 11

2.3.1 Aspergillus niger .………….……….... 11

2.3.2 Pseudomonas aeruginosa ………...… 11

2.3.3 Staphylococcus aureus ………..,,. 12

2.3.4 Escherichia coli.. .………... 13

2.3.5 Bacillus subtilis ……….... 14

2.3.6 Candida albicans .……….... 15

2.4 Tanaman Jamblang……..……….………. 16

2.4.1 Klasifikasi ………...………. 17

2.4.2 Penggunaan Tradisional Tanaman Jamblang ..…………... 17

2.4.3 Kandungan Kimia dan Aktivitas Biologi ………….…….... 18

BAB 3. METODE PENELITIAN ………..... 20

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ………/……….. 20

3.2 Alat dan Bahan ………..………..…………. 20

3.2.1 Alat ………..……….………... 20

3.2.2 Sampel Tumbuhan..……….. 20

3.3.3 Media Pertumbuhan Mikroba ……….…………. 21

xii

3.3.5 Bahan untuk Karakterisasi Kapang Endofit dan Identifikasi

Kemurnian Mikroba Uji………...………... 21

3.3.6 Kontrol Uji Aktivitas Antimikroba ……….…..……... 21

3.3.7 Mikroba Uji ……….………..……... 21

3.3 Prosedur Penelitian ………... 22

3.3.1 Sterilisasi Alat ………... 22

3.3.2 Pembuatan Media ……….……….... 22

3.3.2.1 Pembuatan Media Malt Extract Agar……... 22

3.3.2.2 Pembuatan Media Potato Dextrose Agar... 22

3.3.2.3 Pembuatan Media Agar Miring PDA………... 22

3.3.2.4 Pembuatan Media Nutrient Agar ……... 23

3.3.2.5 Pembuatan Media Agar Miring NA………. 23

3.3.2.6 Pembuatan Media Potato Dextrose Yeast Broth... 23

3.3.2.7 Pembuatan Media Nutrient Broth ……... 23

3.3.3 Isolasi Kapang Endofit ………..…….. 24

3.3.4 Pemurnian Kapang Endofit ………..………... 24

3.3.5 Karakterisasi Kapang Endofit ………. 25

3.3.5.1 Karakterisasi Makroskopik ………..…... 25

3.3.5.2 Karakterisasi Mikroskopik ……….. 25

3.3.6 Identifikasi Kemurnian Mikroba Uji ………..………. 25

3.3.6.1 Identifikasi Kemurnian Bakteri Uji …………..…... 25

3.3.6.2 Identifikasi Kemurnian Jamur Uji ………….…….. 26

3.3.7 Peremajaan Mikroba Uji ………...………. 27

3.3.8 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji ……….………. 27

3.3.9 Pembuatan Inokulum Mikroba Uji ……….…………. 27

3.3.10 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antimikroba ………... 29

3.3.10.1 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antibakteri dan Antikhamir……… 28

3.3.10.2 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antifungi ……….... 29

3.3.11 Fermentasi Kapang Endofit ……….….. 30

3.3.12 Uji Aktivitas Antimikroba dari Supernatan Hasil Fermentasi Kapang Endofit ….………... 30

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ……….... 32

4.1 Isolasi Kapang Endofit ………... 32

4.2 Karakterisasi Kapang Endofit ……….. 36

4.3 Kemurnian Mikroba Uji ………..………... 51

4.4 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji ……….……….. 54

4.5 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antimikroba... 57

4.6 Fermentasi Kapang Endofit ………..………….... 66

4.7 Uji Aktivitas Antimikroba dari Supernatan Hasil Fermentasi Kapang Endofit ….………....…... 68

BAB 5. PENUTUP ………...………... 77

5.1 Kesimpulan ………...……….... 77

5.2 Saran ……….…. 77

DAFTAR PUSTAKA …..………..……….………..….. 78

xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 2.1 Syzygium cumini L. ……….... 16 Gambar 4.1 Isolasi kapang endofit pada daun hijau tua. ..…....………... 34 Gambar 4.2 Isolasi kapang endofit pada daun hijau muda. ...……… 35 Gambar 4.3 Hasil stocking dan working culture isolat kapang endofit ….... 36 Gambar 4.4 Isolat DT1. ……….………....………… 37 Gambar 4.5 Pengamatan mikroskopik isolat DT1 perbesaran 1000x……… 37 Gambar 4.6 Isolat DT2. ……….………....… 38 Gambar 4.7 Pengamatan mikroskopik isolat DT2 perbesaran 1000x……… 38 Gambar 4.8 Isolat DT3. ……….………....… 39 Gambar 4.9 Pengamatan mikroskopik isolat DT3 perbesaran 1000x……… 39 Gambar 4.10 Isolat DT4. ……….……… 40 Gambar 4.11 Pengamatan mikroskopik isolat DT4 perbesaran 1000x…..….. 40 Gambar 4.12 Isolat DT5. ……….………..….. 41 Gambar 4.13 Pengamatan mikroskopik isolat DT5 perbesaran 1000x…….... 41 Gambar 4.14 Isolat DT6. ……….………... 42 Gambar 4.15 Pengamatan mikroskopik isolat DT6 perbesaran 1000x…..….. 42 Gambar 4.16 Isolat DM1. ……….………..…...., 43 Gambar 4.17 Pengamatan mikroskopik isolat DM1 perbesaran 1000x..…….. 43 Gambar 4.18 Isolat DM2. ……….………..………. 44 Gambar 4.19 Pengamatan mikroskopik isolat DM2 perbesaran 1000x..……. 44 Gambar 4.20 Isolat DM3. ……….………... 45 Gambar 4.21 Pengamatan mikroskopik isolat DM3 perbesaran 1000x..……. 45 Gambar 4.22 Isolat DM4. ……….………... 46 Gambar 4.23 Pengamatan mikroskopik isolat DM4 perbesaran 1000x..……. 46 Gambar 4.24 Isolat DM5. ……….………... 47 Gambar 4.25 Pengamatan mikroskopik isolat DM5 perbesaran 1000x..……. 47 Gambar 4.26 Isolat DM6. ……….………... 48 Gambar 4.27 Pengamatan mikroskopik isolat DM6 perbesaran 1000x..……. 48 Gambar 4.28 Isolat DM7. ……….………... 49 Gambar 4.29 Pengamatan mikroskopik isolat DM7 perbesaran 1000x..……. 49 Gambar 4.30 Isolat DM8. ……….………... 50 Gambar 4.31 Pengamatan mikroskopik isolat DM8 perbesaran 1000x..……. 50 Gambar 4.32 Hasil pengamatan mikroskopik bakteri uji dengan

mikroskop perbesaran 1000x………….………... 52 Gambar 4.33 Hasil pengamatan mikroskopik Candida albicans dengan

mikroskop perbesaran 1000x………….………... 53 Gambar 4.34 Hasil pengamatan mikroskopik Aspergillus niger dengan

mikroskop perbesaran 1000x. ………….………... 53 Gambat 4.35 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji………….………. 56 Gambar 4.36 Seleksi kapang endofit terhadap Escherichia coli.……….. 59 Gambar 4.37 Seleksi kapang endofit terhadap Staphylococcus aureus…….... 60 Gambar 4.38 Seleksi kapang endofit terhadap Pseudomonas aeruginosa…… . 61 Gambar 4.39 Seleksi kapang endofit terhadap Bacillus subtillis………... 62

xiv

Gambar 4.40 Seleksi kapang endofit terhadap Candida albicans……..……... 63 Gambar 4.41 Hasil uji antagonis isolat kapang endofit DM8 (B)

terhadap Aspergillus niger (A).…………... 64 Gambar 4.42 Histogram persentase penghambatan kapang endofit

terhadap Aspergillus niger…………...………. 65 Gambar 4.43 Hasil fermentasi isolat kapang endofit………...……... 67 Gambar 4.44 Hasil uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil

fermentasi kapang endofit terhadap Escherichia coli…………. 71 Gambar 4.45 Hasil uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil

fermentasi kapang endofit terhadap Staphylococcus aureus ... 72 Gambar 4.46 Hasil uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil

fermentasi kapang endofit terhadap Bacillus subtillis………... 73 Gambar 4.47 Hasil uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil

fermentasi kapang endofit terhadap Aspergillus niger………... 74 Gambar 4.48 Hasil uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil

fermentasi kapang endofit terhadap Pseudomonas aeruginosa 75 Gambar 4.49 Hasil uji aktivitas antikhamir dari supernatan hasil

xv

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 4.1 Hasil pengamatan makroskopik dan mikroskopik bakteri uji umur

24 jam pada medium NA dengan suhu 37oC……….……….. 51 Tabel 4.2 Hasil pengamatan makroskopik dan mikroskopik Candida albicans

umur 2 hari pada medium PDA pada suhu 29oC.………. 52 Tabel 4.3 Hasil pengamatan makroskopik dan mikroskopik

Aspergillus niger umur 5 hari pada medium PDA suhu 29oC…….. 53 Tabel 4.4 Hasil pengukuran absorbansi bakteri uji pada pembuatan

kurva pertumbuhan………….……….………..….………... 55 Tabel 4.5 Hasil pengukuran zona hambat kapang endofit terhadap

bakteri uji dan khamir uji……….……….………… 58 Tabel 4.6 Data perhitungan presentase penghambatan isolat kapang

endofit terhadap Aspergillus niger………….……….…….. 65 Tabel 4.7 Hasil pengukuran zona hambat dari supernatan hasil fermentasi

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman Jamblang (Syzygium cumini L.).. 83

Lampiran 2. Alur Penelitian. ………..………….. 84

Lampiran 3. Skema Kerja Isolasi Kapang Endofit. ………. 85

Lampiran 4. Skema Kerja Pemurnian Kapang Endofit. …….………. 86

Lampiran 5. Bagan Kerja Karakterisasi Kapang Endofit. …..………. 87

Lampiran 6. Identifikasi Kemurnian Mikroba Uji.………..………….. 88

Lampiran 7. Skema Kerja Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji………..……… 89

Lampiran 8. Pembuatan Suspensi Mikroba Uji……..………….……..….... 90

Lampiran 9. Skema Kerja Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antimikroba…..………….……...…..………….….... 92

Lampiran 10. Skema Kerja Fermentasi Kapang Endofit..…...……….... 93

Lampiran 11. Skema Kerja Pengujian Aktivitas Antimikroba dari Hasil Fermentasi Isolat Kapang Endofit………….……..….... 94

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tanaman merupakan salah satu sumber daya yang sangat potensial yang dijadikan bahan baku dalam pembuatan obat maupun pengobatan. Menurut Deus et al., (1982) dan Stafford et al., (1986) dalam Radji (2005) sebagian besar komponen kimia yang berasal dari tanaman yang digunakan sebagai obat atau bahan obat merupakan metabolit sekunder. Metabolit sekunder seperti alkaloid, terpen, steroid, flavonoid, kuinon, fenol dan lain sebagainya dapat diproduksi oleh mikroorganisme endofit yang dalam habitat aslinya dapat membentuk koloni dalam jaringan tanaman (Bills dan Polyshook, 1992).

Mikroba endofit dapat menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif sebagai senyawa metabolit sekunder yang memiliki daya antimikroba, antimalaria, antikanker, anti HIV, antioksidan dan sebagainya (Strobel, 2003; Prihatiningtias dan Wahyuningsih, 2006). Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan dalam pencarian sumber obat baru. Hal ini dikarenakan mikroba merupakan organisme yang mudah ditumbuhkan, memiliki siklus hidup yang pendek dan dapat menghasilkan jumlah senyawa bioaktif dalam jumlah besar dengan metode fermentasi (Prihatiningtias dan Wahyuningsih, 2006).

Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup pada jaringan tanaman dan tidak membahayakan inangnya. Mikroba endofit dapat ditemukan pada berbagai jaringan tanaman diantaranya biji, ovula, buah, batang, akar, umbi akar, dan daun tetapi tidak menyebabkan penyakit pada tanaman tersebut (Zinneal, 2002; Vega, 2005; Altahi, 2009). Dari sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi, masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri dari bakteri atau fungi. Namun, yang paling umum ditemukan adalah dari jenis fungi (Strobel, 2003). Dreyfuss dan Chapela (1994) dalam Strobel (2002) mengestimasikan terdapat sekitar 1.000.000 spesies fungi endofit di bumi. Kapang adalah bentuk organisme yang paling sering ditemukan sebagai endofit dan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

dilaporkan memiliki potensi yang lebih besar untuk menghasilkan metabolit sekunder yang bermanfaat sebagai senyawa obat dibandingkan bentuk organisme endofit lainnya (Wahyudi, 1998).

Pemanfaatan kapang endofit dalam memproduksi senyawa aktif memiliki beberapa kelebihan, antara lain lebih cepat menghasilkan dengan mutu yang seragam, dapat diproduksi dalam skala besar dan kemungkinan diperoleh komponen bioaktif baru dengan memberikan kondisi yang berbeda (Rante et al., 2013). Selain itu, apabila kapang endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat dapat menghasilkan metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu memanen tanaman aslinya untuk diambil sebagai simplisia yang kemungkinan besar memerlukan waktu puluhan tahun untuk menanamnya (Radji, 2005). Dengan demikian penggunaan kapang endofit sebagai sumber bahan baku obat secara ekonomis diperkirakan lebih efisien dibandingkan dengan menggunakan tumbuhan obat (Sinaga et al., 2009).

Tanaman obat yang berpotensi menghasilkan kapang endofit salah satunya yaitu tanaman jamblang (Syzygium cumini L), family Myrtaceae. Seluruh bagian tanaman seperti biji, buah, daun, bunga, dan kulit kayu digunakan dalam obat tradisional di negara-negara di mana jamblang dilaporkan tumbuh. Bagian daun telah digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai obat untuk diabetes mellitus di banyak negara. Selain itu, daun juga digunakan untuk memperkuat gigi dan gusi, mengobati keputihan, sakit perut, demam, gastropati, stranguria, dermopati, sembelit dan untuk menghambat keluarnya darah dalam tinja (Soni et al., 2011). Di India, jus dari daun digunakan sebagai obat diabetes dan untuk mengatasi sakit perut, sedangkan rebusan buahnya digunakan secara eksternal sebagai astringent dan untuk mengurangi sakit maag. Di Thailand, abu daun digunakan secara eksternal untuk mengurangi rasa gatal yang disebabkan oleh gigitan serangga (Ross, 2003).

Tanaman jamblang diketahui memiliki fitokimia yang beragam dan sebagian besar telah diamati manfaat kesehatannya. Daun diketahui mengandung

β-sitosterol, betulinic acid, mycaminose, crategolic acid, n-hepatcosane, n-nonacosane, n-hentriacontane, noctacosanol, n-triakontanol, n-dotricontanol,

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

quercetin, myricetin, myricitrin, dan glikosida flavonol myricetin

3-O-(4"-acetyl)-α-L-rhamnopyranosides, terasilasi glikosida flavonol. Kulit batang dilaporkan mengandung friedelin, friedelan-3-α-ol, asam betulinic, β-sitosterol, kaempferol,

β-sitosterol-D-glukosida, galat acid, ellagic acid, tanin galat, ellagitannin, dan myricetin. Bunganya diamati mengandung oleanolic acid, ellagic acid, Isoquercetin, quercetin, kaempferol, dan myricetin (Baliga et al, 2011).

Menurut penelitian Rossama (2002), Shafi et al (2002), dan Reddy (2013), menyatakan bahwa minyak atsiri dari daun jamblang dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri dan antijamur. Minyak atsiri dari tanaman family Myrtaceae terkenal akan aktivitas biologisnya dikarenakan keberadaan 1,8-cineole. Monoterpen dan seskuiterpen yang terkandung dalam minyak ini seperti linalool, kamper, geraniol, a-terpineol, P-caryophyllene, nerolidol dan cadinene derivative, memiliki sifat bakterisida (Rossama, 2002). Selain itu, pada penelitian lain menyatakan bahwa ekstrak etanol daun dan ekstrak air biji Syzygium cumini L ditemukan memiliki aktivitas antimikroba yang sangat tinggi terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif (Prabhakaran et al., 2011). Dengan adanya kenyataan ini, isolat kapang endofit dari tanaman jamblang memiliki potensi yang besar dalam usaha penemuan jenis antimikroba baru ataupun jenis obat baru yang lain. Selain itu, penelitian yang dilakukan terhadap kapang endofit tersebut masih sedikit, sehingga perlu untuk diteliti lebih lanjut.

1.2 Rumusan Masalah

Apakah daun tanaman Syzygium cumini L. memiliki isolat kapang endofit yang mempunyai aktivitas antimikroba terhadap Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans dan Aspergillus niger ?

1.3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk :

1. Untuk mengisolasi dan menyeleksi isolat kapang endofit yang berpotensi sebagai antimikroba yang diisolasi dari daun tanaman Syzygium cumini L.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2. Untuk menguji aktivitas antimikroba dari isolat kapang endofit hasil isolasi terhadap Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, dan Aspergillus niger.

1.4 Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini diharapkan :

1. Memberikan informasi bahwa daun tanaman Syzygium cumini L memiliki isolat kapang endofit yang mempunyai aktivitas antimikroba.

2. Memberikan kontribusi bagi perkembangan ilmu pengetahuan terkait penemuan sumber penghasil antimikroba dari isolat kapang endofit pada tanaman.

3. Menambah atau memperkaya koleksi kapang endofit yang di isolasi dari tanaman.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kapang Endofit

Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup didalam jaringan tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya. Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikroba endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat koevolusi atau transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikroba endofit (Radji, 2005).

Dari sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi, masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri dari bakteri atau fungi. Namun, yang paling umum ditemukan adalah dari jenis fungi (Strobel, 2003). Dreyfuss dan Chapela (1994) dalam Strobel (2002). mengestimasikan terdapat sekitar 1.000.000 spesies fungi endofit di bumi Kapang adalah bentuk organisme yang paling sering ditemukan sebagai endofit dan dilaporkan memiliki potensi yang lebih besar untuk menghasilkan metabolit sekunder yang bermanfaat sebagai senyawa obat dibandingkan bentuk organisme endofit lainnya (Wahyudi, 1998).

Kapang endofit merupakan kombinasi antara kapang dan tumbuhan dimana kapang hidup secara sistematik dan umumnya berada didalam tumbuhan (Labeda, 1990). Awalnya keberadaan kapang endofit diduga bersifat netral, maksudnya tidak memberikan pengaruh, baik manfaat maupun kerusakan yang ditimbulkan terhadap tanaman. Ternyata setelah para peneliti mulai mempelajari lebih dalam, ada hubungan simbiosis mutualisme antara kapang endofit dengan tanaman inang terutama peranannya yang sangat penting dalam melindungi tanaman inang terhadap predator dan patogen (Prasetyoputri dan Atmosukarto, 2006).

Dalam simbiosis antara kapang endofit dengan tanaman obat, kapang endofit dapat membantu proses penyerapan unsur hara yang dibutuhkan oleh tumbuhan untuk proses fotosintesis serta melindungi tumbuhan inang dari

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

serangan penyakit, dan hasil dari fotosintesis dapat digunakan oleh kapang untuk mempertahankan kelangsungan hidupnya (Bacon dan Siegel, 1990; Petrini et al., 1992).

2.1.1 Interaksi Kapang Endofit dengan Tanaman

Interaksi kapang endofit dengan inangnya yang ditemukan pada bagian organ tumbuhan tertentu, berhubungan erat dengan siklus hidup yang dilaluinya. Masuknya kapang endofit pada jaringan tanaman inang tergantung pada keberhasilan endofit tersebut menembus lapisan eksternal inangnya. Proses masuknya endofit ini dicapai melalui mekanisme pemecahan atau degradasi jaringan pelindung pada lapisan kutikula dan epidermis (Bacon dan Siegel, 1990).

Proses masuknya endofit ke dalam jaringan tanaman inang terjadi secara langsung dan secara tidak langsung. Secara langsung ditandai dengan masuknya endofit ke dalam bagian internal jaringan pembuluh tanaman dan diturunkan melalui biji, sedangkan secara tidak langsung endofit hanya menginfeksi bagian eksternal yaitu pada bagian pembungaan (Bacon, 1985).

Pada organ atau jaringan tanaman tertentu, ternyata dapat ditempati oleh beberapa jenis mikroorganisme endofit yang berbeda satu sama lainnya. Hal ini merupakan adaptasi dari mikroorganisme endofit terhadap mikroekologi dan kondisi fisiologi yang spesifik dari masing-masing tanaman (Petrini et al., 1992).

2.1.2 Kapang Endofit Penghasil Antimikroba

Fisher (1989) menyatakan bahwa lebih dari 30% kapang endofit yang berhasil diisolasinya memiliki aktivitas terhadap bakteri dan jamur patogen. Banyak kelompok kapang endofit yang mampu memproduksi senyawa antibiotika yang aktif melawan bakteri maupun jamur patogen terhadap manusia, hewan dan tumbuhan, terutama dari genus Coniothirum dan Microsphaeropsis (Petrini et al., 1992).

Pestalotiopsis micrispora merupakan kapang endofit yang paling sering ditemukan di tanaman hutan lindung di seluruh dunia. Kapang endofit ini menghasilkan metabolit sekunder ambuic acid yang berhasiat sebagai antifungi.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Cryptosporiopsis quercina yang berhasil diisolasi dari tanaman obat Tripterigeum wilfordii, dan berkhasiat sebagai antijamur yang patogen terhadap manusia yaitu Candida albicans dan Trichopyton spp (Radji, 2005).

2.1.3 Isolasi Kapang Endofit

Pemilihan bagian tanaman yang tepat menjadi hal yang penting untuk diperhatikan agar didapat isolat kapang endofit yang tepat pula. Bagian tanaman yang dipilih harus sehat dan segar. Sampel tanaman dapat disimpan dalam plastik bersegel dan kering, serta dapat disimpan pada suhu 4°C (Strobel dan Daisy, 2003). Sterilisasi permukaan sampel tanaman perlu dilakukan untuk mengeliminasi mikroba yang berada pada permukaan tanaman. Sterilisasi permukaan dapat dilakukan dengan etanol 75%, NaOCl 2-10%, HgCl, Cu(NO3)2 dan formalin 30-50% (Stone et al., 2004).

Isolasi kapang endofit dapat dilakukan dengan teknik direct seed planting dari bagian tanaman yang sudah disterilisasi terlebih dahulu permukaannya. Kemudian jaringan bagian luar tanaman dihilangkan dengan pisau steril dan bagian dalam tanaman diletakkan hati-hati pada permukaan media isolasi (Strobel, 2003).

Media isolasi yang biasa digunakan adalah MEA (Malt Extract Agar) (1-2%) dan dapat dikombinasi dengan yeast extract (0,1-0,2%). Penggunaan media water agar terkadang lebih disukai karena dapat mengurangi kontaminasi mikroba lainnya (Stone et al., 2004). Selain itu, media PDA (Potato Dextrose Agar) juga sering digunakan dalam mengisolasi kapang endofit. Antibiotik seperti kloramfenikol (0,005% b/v) dan antijamur seperti nistatin (0,01% b/v) sering ditambahkan untuk menghindari kontaminasi mikroba asing (Kumala et al., 2006).

2.2 Antimikroba

Zat antimikroba adalah senyawa biologis atau kimia yang dapat menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba. Menurut Fardiaz (1989), zat antimikroba dapat bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteristatik (menghambat pertumbuhan bakteri), fungisidal, fungistatik atau menghambat

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

germinasi spora bakteri. Kemampuan suatu zat antimikroba dalam menghambat pertumbuhan mikroba dipengaruhi oleh berbagai faktor, yaitu : konsentrasi zat antimikroba, suhu lingkungan, waktu penyimpanan, sifat-sifat mikroba (meliputi jenis, jumlah, umur, dan keadaan mikroba), serta sifat fisik dan kimia makanan termasuk kadar air, pH, jenis, dan jumlah senyawa di dalamnya (Frazier dan Westhoff, 1988).

2.2.1 Mekanisme Kerja Antimikroba

Antimikroba berdasarkan struktur kimia dan mekanisme aksi, dikelompokkan menjadi (Brunton et al., 2006; Pratiwi, 2008) :

a) Agen yang menghambat sintesis dinding sel bakteri. Antimikroba ini merusak lapisan peptidoglikan yang menyusun dinding sel bakteri Gram positif maupun Gram negatif. Mekanisme kerjanya adalah dengan mencegah ikatan silang peptidoglikan pada tahap akhir sintesis dinding sel, yaitu dengan cara menghambat protein pengikat penisilin (penicillin binding protein), protein ini merupakan enzim dalam membran plasma sel bakteri yang secara normal terlibat dalam penambahan asam amino yang berikatan silang dengan peptidoglikan dinding sel bakteri, dan memblok aktivitas enzim transpeptidase yang membungkus ikatan silang polimer-polimer gula panjang yang membentuk dinding sel bakteri sehingga dinding sel menjadi rapuh dan mudah

lisis. Termasuk didalamnya golongan β-laktam (misalnya, penisilin, cephalosporins, dan carbapenems) dan agen lainnya seperti cycloserine, vankomisin, dan bacitracin.

b) Agen yang bekerja secara langsung pada membran sel mikroorganisme, meningkatkan permeabilitas dan menyebabkan kebocoran senyawa intraselular. Membran plasma bersifat semipermeabel dan mengendalikan transport berbagai metabolit kedalam dan luar sel. Adanya gangguan atau kerusakan struktur pada membran plasma dapat menghambat atau merusak kemampuan membran plasma sebagai penghalang (barrier) osmosis dan mengganggu sejumlah proses biosintesis yang diperlukan dalam membran. Termasuk didalamnya deterjen seperti polymyxin, polyene agen antijamur

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

(misalnya, nistatin dan amfoterisin B) yang mengikat dinding sel-sterol, dan lipopeptide daptomycin.

c) Agen yang mengganggu fungsi ribosom subunit 30S atau 50S secara reversibel menghambat sintesis protein, yang umumnya adalah bakteriostatik (misalnya, kloramfenikol, tetrasiklin, eritromisin, klindamisin, streptogramins, dan linezolid) dan bakterisidal (misalnya aminoglikosida).

d) Agen yang mempengaruhi metabolisme asam nukleat bakteri. Penghambatannya pada sintesis asam nukleat berupa penghambatan terhadap transkripsi dan replikasi mikroorganisme, seperti rifamycins (misalnya, rifampisin dan rifabutin) yang menghambat RNA polimerase, dan quinolon yang menghambat topoisomerase.

e) Antimetabolit, yaitu substansi yang secara kompetitif menghambat metabolit mikroorganisme, karena memiliki struktur yang mirip dengan substrat normal bagi enzim metabolisme. Termasuk didalamnya trimetoprimdan sulfonamid, yang menghambat enzim penting metabolisme folat.

2.2.2 Penentuan Aktivitas Antimikroba

Penentuan aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu metode difusi dan metode dilusi. Pada metode difusi termasuk didalamnya metode disk diffusion (tes Kirby & Bauer), E-test, ditch-plate technique, dan cup-plate technique. Sedangkan pada metode dilusi termasuk didalamnya metode dilusi cair dan dilusi padat (Pratiwi, 2008).

a. Metode difusi diantaranya:

1) Metode disk diffusion (tes Kirby & Bauer) menggunakan piringan yang berisi agen antimikroba, kemudian diletakan pada media agar yang sebelumnya telah ditanami mikroorganisme sehingga agen antimikroba dapat berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar.

2) Metode E-test digunakan untuk mengestimasi Kadar Hambat Minimum (KHM), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah sampai tertinggi dan diletakkan pada permukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme sebelumnya. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukan kadar agen antimikroba yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.

3) Ditch-plate technique. Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji (maksimum 6 macam) digoreskan kearah parit yang berisi agen antimikroba tersebut.

4) Cup-plate technique. Metode ini serupa dengan disk diffusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji.

b. Metode dilusi diantaranya:

1) Metode dilusi cair/broth dilution test (serial dilution). Metode ini digunakan untuk mengukur Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM.

2) Metode dilusi padat (solid dilution test). Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.3 Mikroba Uji

Mikroba uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Aspergillus niger, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis dan Candida albicans. Berikut ini adalah penjelasannya.

2.3.1 Aspergillus niger

Klasifikasi Aspergillus niger adalah sebagai berikut : Kingdom : Mycetae

Divisio : Amastigomycota Class : Ascomycotina Ordo : Eurotiales Famili : Eurotiaceae Genus : Aspergillus Spesies : Aspergillus niger

Aspergillus adalah sejenis fungi yang mempunyai bentuk seperti tepung, permukaan berwarna hitam dengan dasar putih sampai kuning. Secara mikroskopis mempunyai konidia yang panjang, lembut dan tidak berwarna. Aspergillus sering ditemukan di alam bebas sebagai saprofit dan bersifat patogen (Gandahusada et al., 1998).

Aspergilosis ialah penyakit jamur yang disebabkan oleh berbagai spesies Aspergillus dan dapat mengenai kulit, kuku dan organ dalam terutama paru-paru dan otak (Gandahusada et al, 1998). Aspergilosis jarang sekali mengenai individu yang normal dan sehat. Penyakit ini selalu mengenai orang-orang yang sudah sakit parah dan lama. Aspergilosis ini dapat di obati dengan vorikonazol, obat ini merupakan antifungi triazol yang bekerja dengan menghambat cytochrome P-450–mediated 14 alpha-lanosterol demethylation yang sangat esensial dalam biosintesis ergosterol jamur (Andra, 2007).

2.3.2 Pseudomonas aeruginosa

Klasifikasi Pseudomonas aeruginosa adalah sebagai berikut : Kingdom : Bacteria

Phylum : Proteobacteria

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Ordo : Pseudomonadales Famili : Pseudomonadaceae Genus : Pseudomonas

Spesies : Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa termasuk ke dalam kelompok bakteri Gram negatif, berbentuk tangkai, berflagel, dapat tumbuh pada suhu antara 35-42oC dan merupakan salah satu spesies dari genus Pseudomonas yang dapat menimbulkan penyakit pada manusia. Dinding selnya tersusun dari lipopolisakarida (LPS) yang terdiri atas 2-keto-3-deoksi-asam oktanat (KDO) dan lipid (Tim Mikrobiologi, 2003).

Infeksi oleh bakteri tersebut terjadi pada seseorang yang mengalami gangguan pada sistem pertahanan tubuh. Oleh karena itu P. aeruginosa disebut patogen oportunistik yaitu memanfaatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu infeksi. Kelainan klinis yang ditimbulkan antara lain: infeksi pada luka bakar, infeksi saluran kemih, endokarditis, gastroenteritis, pneumonia dan lain-lain (Tim Mikrobiologi, 2003).

Umumnya, Pseudomonas aeruginosa resisten terhadap bermacam-macam antimikroba, tetapi masih ada beberapa antimikroba yang efektif untuk mengatasi infeksi oleh bakteri tersebut, antara lain : amikasin, sefotaksim, piperasilin dan vaksin heptavalen (Tim Mikrobiologi, 2003).

2.3.3 Staphylococcus aureus

Klasifikasi Staphylococcus aureus adalah sebagai berikut : Kingdom : Prokaryota

Divisio : Bacteria Class : Schizomyces Ordo : Eubacteriales Famili : Micrococcaceae Genus : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus aureus

Staphylococcus adalah bakteri Gram positif, berbentuk kokus, non motil, dan mampu memfermentasi manitol, menghasilkan koagulase, dan mampu

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

menghasilkan enterotoksin dan Heat-Stable Endonuklease. Sebagian besar bakteri S. aureus pada dinding selnya mengandung protein A yang berikatan dengan peptidoglikan secara kovalen dan asam teikoat (Tim Mikrobiologi, 2003).

Bakteri S. aureus dapat menyerang seluruh tubuh. Bentuk klinisnya tergantung dari bagian tubuh yang terkena infeksi. Di antara contohnya adalah toxic shock syndrom (suatu keadaan yang ditandai dengan panas mendadak, diare dan syok), keracunan makanan, ensefalitis, endokarditis dan septisemia. Bakteri ini dapat di obati dengan penisilin, obat-obat yang tahan terhadap penisilinase dan lain-lainnya. Pada umumnya, semua Staphylococcus sensitif terhadap vankomisin, termasuk MRSA (Tim Mikrobiologi, 2003).

2.3.4 Escherichia coli

Klasifikasi Escherichia coli adalah sebagai berikut : Kingdom : Prokaryota

Divisio : Gracilicutes Class : Scotobacteria Ordo : Eubacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

Escherichia coli adalah salah satu bakteri patogen yang dapat menyebabkan gastroenteritis, dengan gejala mulai diare ringan sampai hemolyticuremic syndrome, gagal ginjal dan kematian. E. coli merupakan mikroflora alami yang terdapat pada saluran pencernaan manusia dan hewan. Keberadaan flora normal dalam saluran pencernaan akan memberikan keuntungan, di antaranya adalah menghambat pertumbuhan bakteri patogen, menghasilkan vitamin B kompleks dan vitamin K (Tim Mikrobiologi, 2003).

Suatu contoh dari kelainan karena gangguan flora normal saluran pencernaan adalah summer diarrhea. Pada musim panas, anak-anak yang mengalami infeksi saluran nafas ringan akan mengalami penurunan nafsu makan, sehingga pemasukan cairan menurun sedangkan jumlah makanan yang harus dicerna oleh usus halus menjadi lebih besar. Hal itu menyebabkan jumlah E.coli

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

meningkat dan asam organik yang dibentuk oleh metabolisme basil kolon ini mengakibatkan iritasi pada usus dan menimbulkan sindroma yang disebut summer diarrhea (Tim Mikrobiologi, 2003).

2.3.5 Bacillus subtilis

Klasifikasi Bacillus subtilis adalah sebagai berikut : Kingdom : Prokaryota

Class : Shizomycetes Ordo : Eubecteriales Famili : Bacillaceae Genus : Bacillus

Spesies : Bacillus subtilis.

Bacillus subtilis adalah bakteri aerobik Gram positif, mempunyai ciri-ciri sel berbentuk batang pendek (rods), sendiri-sendiri, jarang membentuk rantai, motil dengan flagella peritrich, membentuk endospora berukuran 0,8 x 1,5-1,8

μm; permukaan spora terwarnai pucat. Pada spora yang berkecambah, dinding

spora pecah secara melintang (Machmud et al., 2003).

Koloni bakteri pada medium agar berbentuk bundar, tepi tidak teratur, permukaan tidak mengkilap, menjadi tebal dan keruh (opaque), kadang-kadang mengkerut dan berwarna krem atau kecoklatan. Bentuk koloni agak bervariasi pada media yang berbeda. Koloni meluas pesat pada medium yang berpermukaan lembab (Machmud et al., 2003).

Biakan bakteri dari medium padat tidak mudah larut dalam air. Pertumbuhan pada medium cair (broth) keruh, berkerut, dengan pelikel yang koheren, tidak keruh atau hanya agak keruh. Secara anaerob, dalam medium kompleks yang mengandung glukose, pertumbuhan dan fermentasi berlangsung lambat atau lemah; tetapi dengan menambahkan O2 tumbuh cepat serta menghasilkan 2,3-butanediol, asetoin, dan CO2. Bakteri ini mendekomposisi pektin dan polisakarida dari jaringan tanaman, dan beberapa strain membusukkan umbi kentang (Machmud et al., 2003).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.3.6 Candida albicans

Klasifikasi Candida albicans adalah sebagai berikut : Kingdom : Mycetae

Divisi : Amastigomycota Phylum : Proteobacteria Class : Deuteromycetes Ordo : Cryptococcales Famili : Cryptococcaceae Genus : Candida

Spesies : Candida albicans

Candida albicans merupakan jamur dimorfik karena kemampuannya untuk tumbuh dalam dua bentuk yang berbeda yaitu sebagai sel tunas yang akan berkembang menjadi blastospora dan menghasilkan kecambah yang akan membentuk hifa semu. Candida adalah mikroorganisme yang termasuk dalam khamir, sering ditemukan pada manusia dan binatang sebagai saprofit. Bila terdapat faktor predisposisi (keadaan yang menguntungkan pertumbuhan khamir tersebut), maka Candida dapat menimbulkan penyakit primer atau sekunder. Selain itu, Candida juga dapat menimbulkan penyakit yang mendadak atau menahun (Gandahusada et al, 1998).

Candida juga dapat menginfeksi pada kuku. Kelainan ini dapat timbul karena kurang menjaga kebersihan pada kuku, terutama di bawah kuku. Kuku yang terinfeksi Candida dapat merubah warna kuku menjadi seperti susu atau warna lain dan rapuh. Selain menginfeksi kuku, Candida juga dapat menginfeksi kulit. Gejala yang ditimbulkan ialah rasa gatal dan timbul rasa sakit bila terjadi infeksi sekunder. Pada wanita, Candida sering menimbulkan vaginitis dengan gejala utama flour albus (keputihan) yang sering disertai rasa gatal. Kandidiasis vagina dapat juga tanpa gatal, tetapi keluhan yang dikemukakan berupa bertambahnya keputihan bila lelah atau sebelum datang haid (Gandahusada et al., 1998).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.4 Tanaman Jamblang (Syzygium cumini L.)

Syzygium cumini L. (Syn. Eugenia jambolana Lam.) umumnya dikenal sebagai tanaman jamblang, family Myrtaceae. Tanaman ini berasal dari India atau Hindia Timur, dan terdistribusi luas diberbagai negara diantarnya Thailand, Filipina, Myanmar, Sri Lanka, Kepulauan Andaman, Madagaskar, Malaysia, Indonesia, Florida, California, Algeria, Israel, dan berbagai negara lainnya (Lim, 2012; Ross, 2003).

Di Indonesia, tanaman jamblang dikenal dengan berbagai nama, antara lain : Sumatera: jambe kleng (Aceh), jambu kling (Gayo), jambu kalang (Mink.). Jawa: jamblang (Sunda), juwet, duwet, duwet manting (Jawa), dhalas, dhalas bato, dhuwak (Madura). Nusa Tenggara: juwet, jujutan (Bali), klayu (Sasak), duwe (Bima), jambulan (Flores), Sulawesi: raporapo jawa (Makasar), alicopeng (Bugis). Maluku: jambula (Ternate). Melayu: jamlang, jambelang, duwet. Dalam bahasa Inggris orang mengenalnya dengan nama java plum, black plum, jambolan, jambul (Mudiana, 2006).

(a) (b)

Gambar 2.1. Syzygium cumini L. : (a) Pohon; (b) Daun. (Sumber: Koleksi Pribadi, November 2014)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.4.1 Klasifikasi

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta Superdivision : Spermatophyta Division : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida–Dicotyledons Subclass : Rosidae

Ordo : Myrtales Family : Myrtaceae Genus : Syzygium

Species : Syzygium cumini (L.) Skeels

(http://plants.usda.gov, USA Departement Of Agriculture, Desember 2014)

2.4.2 Penggunaan Tradisional Tanaman Jamblang

Semua bagian dari pohon dan biji khususnya, memiliki sejarah panjang penggunaan obat tradisional di negara-negara di mana jamblang dilaporkan tumbuh. Jamblang digunakan secara luas dalam berbagai sistem tradisional obat seperti di Ayurveda, Unani, Siddha, Srilankan, Tibet, dan dalam sistem pengobatan alternatif homeopati dan komplementer. Sebelum penemuan insulin, jamblang berguna dalam pengobatan diabetes dan digunakan baik sendiri atau dalam kombinasi dengan tanaman hipoglikemik lain di Eropa (Baliga et al., 2011).

Bagian daun telah digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai obat untuk diabetes mellitus di banyak negara. Selain itu, daun juga digunakan untuk memperkuat gigi dan gusi, mengobati keputihan, sakit perut, demam, gastropati, stranguria, dermopati, sembelit dan untuk menghambat keluarnya darah dalam tinja (Soni et al, 2011). Di India, jus dari daun digunakan sebagai obat diabetes dan untuk mengatasi sakit perut, sedangkan rebusan buahnya digunakan secara eksternal sebagai astringent dan untuk mengurangi sakit maag. Di Thailand, abu daun digunakan secara eksternal untuk mengurangi rasa gatal yang disebabkan oleh gigitan serangga (Ross, 2003).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Menurut Ayurveda, kulit kayu digunakan sebagai digestive dan astringent. Selain itu, juga berguna untuk mengobati sakit tenggorokan, bronkitis, asma, rasa haus, biliousness, disentri, dan bisul. Abu daun digunakan sebagai dentrificant dan efektif untuk memperkuat gigi dan gusi. Kulit kayu juga dikenal memiliki sifat penyembuhan luka. Dalam sistem obat Siddha, jamblang digunakan sebagai antianemia, meningkatkan produksi sperma dan untuk mengurangi panas yang berlebihan dari tubuh. Menurut sistem obat Unani, jamblang digunakan sebagai obat penyakit hati, untuk memperkaya darah, memperkuat gigi dan gusi. Rebusannya digunakan sebagain lotion yang baik untuk menghilangkan infeksi kurap di kepala (Baliga et al, 2011).

2.4.3 Kandungan Kimia dan Aktivitas Biologi

Tanaman jamblang diketahui memiliki fitokimia yang beragam dan sebagian besar telah diamati manfaat kesehatannya. Daun diketahui mengandung

β-sitosterol, asam betulinic, mycaminose, asam crategolic (maslinic), n-hepatcosane, n-nonacosane, n-hentriacontane, noctacosanol, n-triakontanol,

n-dotricontanol, quercetin, myricetin, myricitrin dan glikosida flavonol myricetin 3-O-(4"-acetyl)-α-L-rhamnopyranosides, terasilasi glikosida flavonol. Minyak

esensial dari daun terbukti mengandung fitokimia pinocarveol, α-terpeneol, myrtenol, eucarvone, murolol, α-myrtenal, cineole, geranyl aseton, α-cadinol dan pinocarvone (Baliga et al, 2011).

Kulit batang dilaporkan mengandung friedelin, friedelan-3-α-ol, asam

betulinic, β-sitosterol, kaempferol, β-sitosterol-D-glukosida, asam galat, ellagic asam, tanin galat, ellagitannin dan myricetin. Bunganya diamati mengandung asam oleanolic, asam ellagic, Isoquercetin, quercetin, kaempferol dan myricetin (Baliga et al, 2011).

Penelitian menunjukkan bahwa daging buah jamblang berisi antosianin, delphinidin, petunidin, malvidin-diglucoside, dan senyawa ini bertanggung jawab untuk warna ungu cerah. Biji adalah bagian tanaman yang paling banyak dipelajari dan dilaporkan mengandung jambosine, asam galat, asam ellagic, corilagin, diphenoylglucose 3,6-hexahydroxy, diphenoylglucose 4,6-hexahydroxy, 1-galloylglucose, 3-galloylglucose, quercetin, dan β- sitoterol (Baligaet al, 2011).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Tanaman ini memiliki kegunaan sebagai obat yang sangat potensial. Seluruh bagian tanaman seperti biji, buah, daun bunga, kulit kayu memiliki berbagai sifat obat seperti antimikroba, antivirus, antiinflamasi, antigenotoksik, antiulcerogenic, kardioprotektif, antialergi, antikanker, kemoterapi preventif, radio protektif, antioksidan, hepatoprotektif, antidiare, efek hipoglikemik dan antidiabetes (Yadav et al., 2014).

Menurut penelitian Rossama (2002), Shafi et al (2002), dan Reddy (2013), menyatakan bahwa minyak atsiri dari daun jamblang dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri dan antijamur. Minyak atsiri dari tanaman family Myrtaceae terkenal akan aktivitas biologisnya dikarenakan keberadaan 1,8-cineole. Monoterpen dan seskuiterpen yang terkandung dalam minyak ini seperti linalool, kamper, geraniol, a-terpineol, P-caryophyllene, nerolidol dan cadinene derivative, memiliki sifat bakterisida (Rossama, 2002).

Hasil penelitian Prabhakaran et al., (2011) menunjukkan bahwa ekstrak jamblang mengandung karbohidrat, fenol, flavonoid dan tanin sebagai metabolit sekunder. Selain itu, dalam penelitian tersebut menyatakan bahwa ekstrak etanol daun dan ekstrak air biji Syzygium cumini L ditemukan memiliki aktivitas antimikroba yang sangat tinggi terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari sampai Juni 2015 di Laboratorium Farmakogosi Fitokimia, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta.

3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat

Laminar Air Flow (Minihelix II), inkubator (France Etuves), oven

(Memmert), shaker incubator (Stuart Scientific), autoklaf (All American), autoklaf otomatis (ALP), alat sentrifus (Hettich Zentrifugen), spektrofotometri UV-Vis (Hitachi), tabung sentrifus, vortex (Thermolyne), hot plate (Thermo Scientific), timbangan analitik (AND), mikroskop cahaya (Motic), cover glass, kaca objek, ose bulat, bunsen, cawan petri (Normax), paper disc 6mm (Oxoid), mikro pipet dan tip (Bio Rad), pH indikator, labu Erlenmeyer, beaker glass, tabung reaksi (Pyrex), gelas ukur (Pyrex), spatula, magnetik stirer, batang pengaduk, kaca arloji, kuvet, batang L, batang drygalski, pinset, pipet tetes, tube, pisau, silet, tisu steril, kapas, kasa, tali, alumunium foil, plastic wrap, kertas saring, perkamen, jangka sorong (Tricle Brand), dan alat-alat gelas lain yang biasa digunakan di laboratorium mikrobiologi.

3.2.2 Sampel Tumbuhan

Sampel tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tumbuhan jamblang (Syzygium cumini L.) yang diambil pada tanggal 4 Februari 2015 dari SDN Kampung Tengah 07 Pg. Jl. Trikora IV Rt. 05/ Rw 07 Kelurahan Tengah, Pasar Rebo, Jakarta Timur. Tumbuhan ini telah dideterminasi di Lembaga Ilmu pengetahuan Indonesia (LIPI), Herbarium Bogoriense, Cibinong, Bogor.

Sampel daun yang digunakan sebanyak 6 helai yang terdiri dari 3 helai daun hijau tua dan tiga helai daun hijau muda. Daun hijau tua memiliki ciri daun

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

berwarna hijau tua, tebal, dan kaku. Sedangkan daun hijau muda memiliki ciri daun berwarna hijau muda, daun tipis dan lentur. Sampel daun yang digunakan yaitu daun yang masih segar, tidak layu atau tidak menguning dan bebas dari kontaminasi (tidak ada bercak hitam atau jamur yang menempel pada daun).

3.2.3 Media Pertumbuhan Mikroba

Malt Extract Agar (MEA, Oxoid), Potato Dextrose Agar (PDA, Merck), Potato Dextrose Broth (Oxoid), Nutrient Agar (NA, Merck), Nutrient Broth (NB, Merck), Yeast Extract (YE, Merck), dan kalsium karbonat (CaCO3).

3.2.4 Bahan untuk Sterilisasi Permukaan

Air mengalir, etanol 70 %,NaOCL 5.25% (Baycline), dan akuadest steril.

3.2.5 Bahan untuk Karakterisai Kapang Endofit dan Identifikasi Kemurnian Mikroba Uji

NaCl 0.9%, standar Mc Farland III, larutan kristal violet, lugol, alkohol 70%, alkohol 96%, larutan safranin, dan methylene blue.

3.2.6 Kontrol Uji Aktivitas Antimikroba

Cakram kloramfenikol 30 µg/cakram (Oxoid), cakram nistatin 100 µg/cakram (Oxoid), dan cakram aquadest steril.

3.2.7 Mikroba Uji

Mikroba uji yang digunakan yaitu bakteri Gram positif (Bacillus subtillis ATCC 6633 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923), bakteri Gram negatif (Escherichia coli ATCC 25922 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853), kapang (Aspergillus niger ATCC 16404), dan khamir (Candida albicans ATCC 10231). Mikroba tersebut diperoleh dari Labotarorium Mikrobiologi Farmasi FMIPA UI.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Sterilisasi Alat

Untuk alat-alat yang tidak tahan pemanasan dengan suhu tinggi, sterilisiasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121˚C selama 15 menit. Untuk alat-alat yang terbuat dari gelas, disterilkan dengan menggunakan oven suhu 160˚C selama 2 jam. Sedangkan alat-alat logam disterilkan dengan cara dipijarkan menggunakan api spiritus (Kumar, 2012).

3.3.2 Pembuatan Media

3.3.2.1 Pembuatan Media Malt Extract Agar (MEA)

Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media MEA dibuat dengan cara MEA sebanyak 50 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuades. Media tersebut dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer. Campuran media tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit. Media dituang ke dalam cawan petri steril masing-masing ±10 mL dan biarkan hingga memadat.

3.3.2.2 Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA)

Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media PDA dibuat dengan cara PDA sebanyak 39 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media tersebut dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer. Campuran media tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit. Media dituang ke dalam cawan petri steril masing-masing ±10 mL dan biarkan hingga memadat.

3.3.2.3 Pembuatan Media Agar Miring PDA

Media agar miring PDA dibuat dengan cara PDA sebanyak 39 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media tersebut dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer. Campuran media tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 mL lalu disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1 atm

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

selama 15 menit. Setelah disterilisasi, tabung reaksi tersebut diletakkan dalam posisi miring ± 45o dan biarkan hingga memadat (Jauhari, 2010).

3.3.2.4 Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)

Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media NA dibuat dengan cara NA sebanyak 20 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media tersebut dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate and stirrer. Campuran media tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit. Media dituang ke dalam cawan petri steril masing-masing 10 mL dan biarkan hingga memadat.

3.3.2.5 Pembuatan Media Agar Miring NA

Media NA miring dibuat dengan cara NA sebanyak 20 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media tersebut dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate and stirrer. Campuran media tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 mL lalu disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah disterilisasi, tabung reaksi tersebut diletakkan dalam posisi miring ± 45o dan biarkan hingga memadat (Jauhari, 2010)

3.3.2.6 Pembuatan Media Potato Dextrose Yeast (PDY) Broth

Potato Dextrose Broth dan Yeast Agar masing-masing sebanyak 24 gram dan 2 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media tersebut dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer. Sambil diaduk, kalsium karbonat (CaCO3) ditambahkan kedalam larutan hingga mencapai pH 6. Media tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit (Jauhari, 2010).

3.3.2.7 Pembuatan Media Nutrient Broth (NB)

Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media NB dibuat dengan cara NB sebanyak 8 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media tersebut dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

menggunakan hot plate dan stirrer. Campuran media tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit.

3.3.3 Isolasi Kapang Endofit

Kapang endofit diisolasi dari daun tanaman Syzygium cumini L. Daun yang digunakan adalah daun hijau muda dan daun hijau tua. Isolasi kapang endofit dilakukan mengikuti metode Fisher et al., (1993) yang dimodifikasi. Sampel daun tanaman jamblang di cuci dengan air mengalir selama 10 menit. Sampel daun yang telah dicuci kemudian disterilisasi permukaan dengan cara daun direndam ke dalam etanol 70% selama 1 menit, kemudian direndam ke dalam larutan NaOCl 5,25% selama 5 menit, lalu direndam kembali ke dalam etanol 70% selama 30 detik, dan terakhir dibilas dengan akuadest steril selama 5 detik. Daun yang telah disterilisasi permukaannya diletakkan di atas kertas saring steril dan dibiarkan hingga kering di udara. Setelah kering, daun dipotong menjadi bagian kecil dengan ukuran 1x1 cm2 dengan pisau steril.

Potongan sampel diletakkan pada cawan petri yang berisi media MEA. Inokulasi sampel dilakukan triplo dan tiap cawan berisi 2 potongan daun. Selain itu pada akuadest bilasan terakhir diambil 1 mL dan diisolasi ke media MEA lainnya, perlakuan ini berfungsi sebagai kontrol. Selama pekerjaan dilakukan di dalam laminar air flow dan kemudian media yang telah diinokulasi potongan sampel dan media kontrol diinkubasi pada suhu 29oC selama 5–21 hari tergantung tingkat pertumbuhan kapang. Isolat endofit yang menunjukkan sifat morfologi jamur dipindahkan ke media MEA yang baru sampai diperoleh isolat murni.

3.3.4 Pemurnian Kapang Endofit

Kapang endofit yang telah tumbuh pada media isolasi MEA, kemudian secara bertahap dimurnikan satu persatu. Masing-masing isolat murni kapang endofit yang diperoleh dipindahkan ke dalam media MEA plate lain. Pemurnian ini bertujuan untuk memisahkan koloni endofit dengan morfologi yang berbeda untuk dijadikan isolat tersendiri. Pengamatan morfologi dilakukan kembali setelah inkubasi selama 5-7 hari, dan apabila masih ditemukan pertumbuhan koloni yang berbeda secara makroskopik maka harus dipisahkan kembali sampai diperoleh

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

isolat murni. Setiap isolat murni dibuat duplo pada agar miring. Masing-masing sebagai kultur stok (stock culture) dan kultur untuk penelitian (working culture) dan diinkubasi pada suhu 29oC selama 5-7 hari sesuai dengan pertumbuhannya (Noverita et al., 2009).

3.3.5 Karakterisasi Kapang Endofit

Karakterisasi kapang dilakukan dengan mengamati karakter morfologi baik secara makroskopis maupun secara mikroskopis.

3.3.5.1 Karakterisasi Makroskopik

Karakterisasi makroskopik dilakukan dengan mengamati morfologi koloni meliputi warna koloni, warna sebalik koloni (reverse color), tekstur (granular, seperti tepung, seperti beludru, seperti kapas), zonasi, dan tetes eksudat (exudates drops) (Gandjar, 2000).

3.3.5.2 Karakterisasi Mikroskopik

Karakterisasi mikroskopik dilakukan dengan melakukan pemeriksaan preparat kapang melalui mikroskop. Caranya adalah, kaca objek dan kaca penutup dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%, kemudian di atas kaca objek diletakkan potongan media MEA berukuran 1x1 cm2 yang berisi bagian hifa kapang lalu ditutup dengan cover glass. Preparat tersebut kemudian ditempatkan pada cawan petri steril yang sebelumnya telah diberi alas kertas tissu yang dibasahi dengan akuades steril. Selanjutnya diInkubasi selama 7 hari pada suhu 29oC. Setelah inkubasi selesai, cover glass dilepaskan, lalu ditetesi 1 tetes alkohol 70% dan 1 tetes methylene blue, kemudian ditutup dengan cover glass dan diamati dengan mikroskop cahaya dari perbesaran terkecil hingga terbesar Pengamatan yang dilakukan meliputi ada atau tidak adanya sekat pada hifa, pertumbuhan hifa, bentuk dan warna konidia (Yulia 2005; Ramadhan, 2011; Sundari, 2012).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.6 Identifikasi Kemurnian Mikroba Uji 3.3.6.1 Identifikasi Kemurnian Bakteri Uji

Identifikasi kemurnian bakteri uji dilakukan secara makroskopik dan mikroskopik pada bakteri uji yang berusia 24 jam. Identifikasi makroskopik dilakukan dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni meliputi warna koloni, tepi koloni, permukaan koloni, bentuk koloni, dan diameter koloni.

Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan metode pewarnaan Gram. Kaca objek dibersihkan dahulu dengan kain bersih yang sudah dibasahi dengan alkohol 70%, kemudian dilewatkan di atas api untuk menghilangkan lemak dan dibiarkan dingin sebelum dipakai. Selanjutnya dibuat suspensi bakteri dengan satu sengkelit NaCl fisiologis di atas gelas objek lalu difiksasi dengan melewatkan kaca objek pada api bunsen. Selanjutnya, preparat dipaparkan oleh larutan kristal violet selama 1 menit. Kaca objek dicuci dengan air yang mengalir selama 5 detik. Kemudian dicuci dengan pereaksi poliiodida (lugol), dibiarkan selama 1 menit. Kaca objek dicuci dengan air mengalir. Preparat kemudian dicuci dengan alkohol 96% sampai tidak ada lagi pewarna yang terbawa oleh etanol selama 30 detik. Preparat ditetesi larutan Safranin selama 1 menit. Dicuci kembali dengan air mengalir. Preparat dikeringkan dengan cara diletakkan di atas tisu steril dan selanjutnya diamati dengan mikroskop cahaya dari perbesaran terkecil hingga terbesar (Rustanti, 2007).

3.3.6.2 Identifikasi Kemurnian Jamur Uji

Identifikasi kemurnian jamur uji dilakukan secara makroskopik dan mikroskopik pada jamur uji yang berusia 3-5 hari. Identifikasi makroskopik jamur uji dilakukan dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni. Pengamatan morfologi kapang secara makroskopik meliputi warna koloni, warna sebalik koloni (reverse colony), tekstur koloni, ada tidaknya tetes eksudat (exudate drops), zonasi dan sporulasi (Gandjar, 2000). Sedangkan pengamatan morfologi khamir secara makroskopik meliputi warna koloni, tekstur koloni, permukaan koloni, profil koloni, dan tepi koloni (Kurtzman dan Fell, 1998).

Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan cara kaca objek dan kaca penutup dibersihkan dengan alkohol 70%. Methylene blue diteteskan di atas kaca

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

objek yang telah dibersihkan dengan alkohol. Miselium diambil yang sudah bersporulasi, atau sesuai yang diperlukan, dan diurai hati-hati dengan jarum preparat. Kaca penutup diletakkan secara hati-hati di atas permukaan preparat dan kelebihan methylene blue diserap dengan kertas saring. Preparat diamati di bawah mikroskop cahaya dari perbesaran terkecil hingga terbesar (Gandjar, 2000).

3.3.7 Peremajaan Mikroba Uji

Peremajaan Candida albicans dan Aspergillus niger diinokulasikan masing-masing sebanyak satu ose ke medium agar miring PDA, Aspergillus niger pada agar miring PDA diinkubasi selama 5 hari pada suhu 29ºC, sedangkan Candida albicans pada agar miring PDA dieramkan selama 3 hari pada suhu 29ºC. Sedangkan peremajaan Bacillus subtillis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus diinokulasikan masing-masing satu ose ke dalam medium NA miring, kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37oC. Pengerjaan dilakukan dalam kondisi steril di dalam laminar air flow (Jauhari, 2010).

3.3.8 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Bakteri uji pada media agar miring NA yang telah diinkubasi selama 24 jam ditambahkan 5 mL NaCl 0,9% steril. Sebanyak 0,2 mL suspensi bakteri masing-masing diinokulasikan ke dalam labu Erlenmeyer 250 ml yang berisi media NB 200 mL. Selanjutnya media diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 37oC. Pertumbuhan bakteri uji diamati dengan mencuplik 1 mL suspensi bakteri setiap interval 1 jam dan mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS. Dari hasil pengukuran tersebut dibuat kurva pertumbuhan bakteri uji. Kurva pertumbuhan diakhiri setelah melewati fase stasioner (Jauhari, 2010; Khotimah, 2010).

3.3.9 Pembuatan Inokulum Mikroba Uji

Suspensi bakteri dibuat dengan cara, masing-masing bakteri uji pada agar miring NA yang telah diinkubasi selama 24 jam ditambahkan 5 mL NaCl 0.9%.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Kemudian 0,1 mL suspensi bakteri tersebut dimasukkan kedalam 10 mL media NB dan diinkubasi dengan shaker incubator (120 rpm, suhu 37oC) sesuai dengan fase log masing-masing bakteri. Selanjutnya, masing-masing suspensi bakteri uji pada fase log diambil 0,1 mL lalu diratakan diatas medium NA yang telah memadat (Xu, 2010). Media NA ini selanjutnya digunakan untuk seleksi dan pengujian antimikroba.

Suspensi Candida albicans dibuat dengan cara, sebanyak satu ose biakan Candida albicans yang berumur 3 hari dimasukkan kedalam 2 mL larutan NaCl fisiologis 0,9% steril, kemudian dihomogenkan dengan vortex. Kekeruhannya diseragamkan dengan menggunakan standar Mc Farland III yang setara dengan 9x108 CFU/mL. Selanjutnya, suspensi Candida albicans 109 diencerkan hingga pengenceran 10000 kali sehingga diperoleh suspensi 105. Pengenceran dilakukan dengan cara suspensi 109 dipipet 1 mL ke dalam tabung reaksi berisi 9 mL NaCl 0,9% sehingga diperoleh suspensi mikroba 108. Suspensi mikroba 108 dipipet 1 mL ke dalam tabung reaksi berisi 9 mL NaCl 0,9% sehingga diperoleh suspensi mikroba 107. Demikian seterusnya hingga diperoleh suspensi Candida albicans 105 (Rachmayani, 2008). Suspensi Candida albicans 105 diambil 0,1 mL lalu diratakan diatas medium PDA yang telah memadat (Xu, 2010). Media PDA ini selanjutnya digunakan untuk seleksi dan pengujian antimikroba.

Untuk kapang Aspergillus niger suspensi dibuat dengan cara biakan kapang pada medium PDA miring yang telah diinkubasi selama 7 hari pada suhu 29oC dimasukkan 1 mL akuadest steril, spora dikerik dengan ose dan dimasukkan secara aseptis kedalam tabung reaksi yang berisi 9 mL akuadest streril, lalu dihomogenkan dengan menggunakan vortex sehingga diperoleh suspensi spora pengenceran 10-1. Kemudian dlakukan pengenceran secara bertingkat sehingga diperoleh pengenceran sampai 10-6. Pengenceran dilakukan dengan cara suspensi 10-1 dipipet 1 mL ke dalam tabung reaksi berisi 9 mL akuadest streril sehingga diperoleh suspensi mikroba 10-2. Suspensi mikroba 10-2 dipipet 1 mL ke dalam tabung reaksi berisi 9 mL akuadest streril sehingga diperoleh suspensi mikroba 10-3. Demikian seterusnya hingga diperoleh suspensi mikroba 10-6 (Atika, 2007; Handayani, 2007). Media PDA ini selanjutnya digunakan untuk seleksi dan pengujian antimikroba.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.10 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antimikroba

3.3.10.1 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antibakteri dan Antikhamir

Seleksi kapang endofit yang berpotensi sebagai antibakteri dan antikhamir dilakukan dengan metode difusi agar padat (Diffusion Agar Plate Methode). Isolat murni kapang endofit yang telah dimurnikan pada media MEA diambil dengan sedotan steril berdiameter 6 mm dan dipindahkan ke media NA yang telah ditanami bakteri uji dan ke media PDA yang telah ditanami khamir uji. Satu cawan petri media NA yang berisi bakteri uji dan media PDA yang berisi khamir uji dapat ditanami potongan isolat murni kapang endofit sebanyak 6 isolat. Kultur diinkubasi pada suhu 37oC selama 1-2 hari untuk kultur yang berisi bakteri uji dan inkubasi pada suhu 29oC selama 2-3 hari untuk kultur yang berisi khamir uji. Aktivitas antibakteri kapang endofit dilihat dari zona hambat yang terbentuk (Elfina et al., 2014). Isolat yang menunjukkan zona hambat dipilih sebagai isolat untuk pengujian selanjutnya yaitu fermentasi dan uji aktivitas antimikroba.

3.3.10.2 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antifungi

Seleksi kapang endofit yang berpotensi sebagai antifungi dilakukan menggunakan uji antagonis kapang endofit terhadap Aspergillus niger dengan metode oposisi langsung, yaitu dengan cara isolat murni kapang endofit yang telah dimurnikan pada media MEA dan kultur kapang Aspergillus niger, masing-masing diambil dengan sedotan steril berdiameter 6 mm, lalu dipindahkan ke media PDA. Posisi isolat kapang endofit dan kapang Aspergillus niger diletakkan secara yang berhadapan dengan jarak satu sama lain 3 cm pada cawan petri berdiameter 9 cm. Selanjutnya media diinkubasi pada suhu 29oC sampai 7 hari (Wulandari et al., 2014). Pengamatan daya hambat kapang endofit dilakukan sejak 1 hari setelah inokulasi sampai 7 hari. Daya hambat kapang antagonis diketahui dengan menghitung pertumbuhan koloni dengan menggunakan rumus :

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Keterangan :

I = Persentase penghambatan.

R1 = Jari-jari koloni patogen yang arah pertumbuhannya menjauhi koloni kapang endofit.

R2 = Jari-jari koloni patogen yang pertumbuhannya mendekati koloni kapang endofit.

3.3.11 Fermentasi Kapang Endofit

Fermentasi kapang endofit dilakukan dengan fermentasi cair menggunakan media Potato Dextrose Yeast (PDY) Broth. Koloni murni isolat kapang endofit yang terseleksi diambil sebanyak 5 potongan biakan kapang menggunakan sedotan steril lalu diinokulasikan ke dalam media fermentasi cair PDY sebanyak 200 mL dalam labu Erlenmeyer ukuran 250 mL. Selanjutnya media diinkubasi secara statis pada suhu kamar 29oC selama 14 hari (Noverita et al., 2009).

3.3.12 Uji Aktivitas Antimikroba dari Supernatan Hasil Fermentasi Kapang Endofit

Pengujian aktivitas antimikroba dari supernatan hasil fermentasi kapang endofit dilakukan dengan metode Kirby-Bauer yang dikenal dengan sebutan metode cakram kertas. Tiap-tiap cakram kertas steril berdiamter 6 mm ditetesi dengan supernatan hasil fermentasi sebanyak 20 µL Cakram yang telah berisi supernatan, kemudian didiamkan hingga kering sebelum diletakkan pada media uji. Selanjutnya secara aseptik, setelah kertas cakram menyerap supernatan tersebut, masing-masing kertas cakram diletakkan pada permukaan medium yang telah berisi mikroba uji. Jumlah cakram kertas yang diletakkan dalam satu cawan petri berisi 6-7 buah, dan masing-masing jarak antara cakram diatur supaya tidak terlalu dekat (Noverita et al., 2009).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Sebagai kontrol positif untuk uji aktivitas antibakteri digunakan cakram kloramfenikol dan sebagai kontrol positif untuk uji aktivitas antifungi digunakan cakram nistatin. Sedangkan sebagai kontrol negatif digunakan cakram yang berisi akuadest steril. Pengujian dilakukan dengan tiga kali pengulangan.

Media biakan uji diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.untuk uji aktivitas antibakteri dan inkubasi selama 3-5 hari pada suhu 29oC untuk uji aktivitas antifungi. Setelah diinkubasi, dilakukan pengukuran zona hambat yang terbentuk menggunakan jangka sorong (Noverita et al., 2009).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi Kapang Endofit

Pada penelitian ini berhasil diisolasi empat belas koloni kapang endofit dari daun tanaman jamblang (Syzygium cumini L.). Keempat belas isolat kapang endofit ini terdiri dari enam isolat kapang endofit dari daun hijau tua (DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, dan DT6) dan delapan isolat kapang endofit dari daun hijau muda (DM1, DM2, DM3, DM4, DM5, DM6, DM7, dan DM8). Keempat belas isolat kapang endofit ini dianggap sebagai kapang endofit bila memiliki ciri-ciri, waktu tumbuh lebih dari 5 hari, tumbuh disekitar sampel daun yang ditanam dan memiliki morfologi yang berbeda dari kapang yang tumbuh pada cawan petri kontrol. Selain itu, untuk menentukan keempat belas endofit ini berbeda juga dapat dilihat dari waktu pertumbuhannya. Hasil isolasi kapang endofit dapat dilihat pada gambar 4.1 dan gambar 4.2.

Proses isolasi dilakukan menggunakan media MEA (Malt Extract Agar). Media MEA merupakan media yang umum digunakan untuk isolasi, deteksi, kultivasi dan enumerasi kapang maupun khamir (Galloway dan Burgess, 1952). Media ini mengandung malt extract yang digunakan sebagai sumber nutrisi yang menguntungkan untuk pertumbuhan dan metabolisme kapang maupun khamir, serta memberikan lingkungan asam yang baik untuk menekan pertumbuhan bakteri. Selain itu, media ini juga mengandung pepton mikologi yang berfungsi sebagai sumber nitrogen sehingga memberikan pertumbuhan yang cepat pada kapang maupun khamir serta memberikan morfologi dan pigmentasi yang khas.

Proses isolasi dimulai dengan melakukan sterilisasi permukaan terhadap sampel daun yang akan digunakan. Sterilisasi permukaan bertujuan mengeliminasi mikroorganisme epifit yang ada pada permukaan tanaman dengan cairan desinfektan. Pada proses sterilisasi ini digunakan alkohol 70% dan NaOCl 5,25%. Mekanisme kerja dari alkohol adalah mendenaturasi protein dan melarutkan lemak pada membran protein mikroba sehingga merusak membran sel mikroba. Proses denaturasi tersebut memerlukan air sehingga alkohol 70% lebih

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

tinggi aktivitasnya daripada alkohol absolut (Siswandono, 1995). Kemampuan alkohol untuk mensterilkan permukaan organ tanaman mempunyai spektrum yang sempit. Oleh karena itu, biasanya dikombinaskan dengan desinfektan lain yaitu NaOCl. NaOCl 5,25% merupakan desinfektan umum yang juga digunakan pada proses sterilisasi permukaan (Stone et al., 2004). NaOCl bekerja mengoksidasi sel mikroorganisme sehingga mengganggu reaksi enzimatis pada metabolisme mikroorganisme (Volk dan Wheeler, 1988).

Kapang endofit yang telah tumbuh pada media isolasi MEA, kemudian secara bertahap dimurnikan satu persatu ke dalam media MEA plate baru sehingga didapat isolat murni kapang endofit. Pemurnian ini bertujuan untuk memisahkan koloni endofit dengan morfologi yang berbeda untuk dijadikan isolat tersendiri. Hal ini dilakukan terus-menerus sampai diperoleh koloni murni. Koloni murni adalah koloni yang memiliki morfologi yang sama karena berasal dari pembelahan satu sel (Waluyo, 2005).

Selanjutnya setiap isolat murni yang didapat dibuat duplo pada agar miring dengan memindahkan miselium isolat kapang endofit ke medium agar miring MEA dengan menggunakan ose. Masing-masing sebagai kultur stok (stock culture) dan kultur untuk penelitian (working culture) dan diinkubasi pada suhu 29oC selama 5-7 hari sesuai dengan pertumbuhannya. Hasil stocking dan working culture dapat dilihat pada gambar 4.3.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Isolasi Kapang Endofit pada Daun Hijau Tua Hari ke-5

Cawan 1

Cawan 2 Cawan 3

Hari ke-7

Cawan 1 Cawan 2 Cawan 3

Hari ke-14

Cawan 1 Cawan 2 Cawan 3

Kontrol

Lampiran 6. Identifikasi Kemurnian Mikroba Uji (Lanjutan) 2. Identifikasi Kemurnian Jamur Uji

 Pengamatan Makroskopik

 Pengamatan Mikroskopik

Lampiran 7. Skema Kerja Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji Jamur uji yang berusia 3-5 hari

 Pengamatan A.niger :

Warna permukaan koloni, warna sebalik koloni, tekstur koloni, zonasi, sporulasi, dan tetes eksudat.

 Pengamatan C.albicans :

warna koloni, tekstur koloni, permukaan koloni, profil koloni, dan tepi koloni

Inkubasi dalam shaker

incubatordengan

kecepatan 120 rpm pada suhu 37oC

Bakteri uji + 5 mL NaCL 0,9% steril

0,2 mL

Media NB 200 mL

Ukur absorbansinya pada Setiap interval 1 jam

Diakhiri setelah melewati fase stasioner

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 8. Pembuatan Suspensi Mikroba Uji

1. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

2. Pembuatan Suspensi Candida albicans

1 mL

Biakan

C.albicansyang

berumur 3 hari

Mc Farland III 109

108 107

100 µL

Masukkan beberapa sengkelit ke dalam 2 mL NaCl-fisiologis

Pipet 1ml ke 9 ml NaCl-fisiologis

Media PDA Samakan

Kekeruhan

1 mL

Di ratakan dengan batang Drigalski

106 105 1 mL

Bakteri uji + 5 mL NaCL 0,9% steril

0,1 mL

Media NB 10 mL

Inkubasi dalam shaker

incubatordengan

kecepatan 120 rpm pada suhu 37oC, sesuai fase

log masing-masing bakteri uji

100 µL

Lampiran 8. Pembuatan Suspensi Mikroba Uji (Lanjutan) 3. Pembuatan Suspensi Aspergillus niger

100 µL 10-3 ₁₀-4

10-5 10-6

1 mL _{1 mL 1 mL 1 mL}

1 mL

Pipet 1 ml ke 9 ml akuadest steril

Biakan A.niger yang berumur 5

hari + 1 mL akuadest steril

10-1 10-2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 9. Skema Kerja Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai

Antimikroba

1. Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antibakteri dan Antikhamir

2. Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antifungi Diinokulasikan ke

dalam medium PDA pada waktu bersamaan Isolat

murni kapang endofit

Aspergillus niger

Inkubasi suhu 29oC. sampai dengan patogen tumbuh

memenuhi cawan Petri Keterangan :

I = Persentase penghambatan. R1 = Jari-jari koloni patogen yang

arah pertumbuhannya menjauhi koloni kapang endofit.

R2 = Jari-jari koloni patogen yang pertumbuhannya mendekati koloni kapang endofit.

Isolat murni kapang endofit

dalam MEA

Diambil dengan sedotan steril berdiameter 6 mm

Dipindahkan ke media NA yang telah ditanami

bakteri uji.

Diinkubasi pada suhu 29oC. selama 4 hari. Aktivitas antibakteri kapang endofit dilihat dari zona hambat yang

Lampiran 10. Skema Kerja Fermentasi Kapang Endofit

Diambil 5 potongan agar dengan sedotan steril Dimasukkan ke dalam media PDY cair 200 mL Isolat kapang endofit

yang terseleksi

Inkubasi pada suhu 29oC selama 14 hari

Sentrifuse 3000 rpm selama 20 menit Supernatan

Larutan Uji

10 mL

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 11. Skema Kerja Pengujian Aktivitas Antimikroba dari Hasil

Fermentasi Isolat Kapang Endofit

amoksisilin. Sebanyak 20 µl larutan amoksisilin konsentrasi 2 mg/ml Supernatan

Larutan Uji

Resapkan masing-masing 20 µL pada kertas cakram steril

Setiap cawan berisi cakram larutan uji, cakram kontrol positif dan cakram kontrol negatif.

cakram larutan uji

cakram kontrol positif (kloramfenikol untuk uji antibakteri) (nistatin untuk uji antifungi)

cakram kontrol negatif (akuadest steril)

Media diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.untuk uji aktivitas antibakteri dan inkubasi selama 3-5 hari pada suhu 29oC untuk uji aktivitas antifungi.

Zona hambatan yang terbentuk diukur diameternya dengan jangka sorong Cakram diletakkan pada media NA dan PDA yang