UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Sterilisasi Alat
Untuk alat-alat yang tidak tahan pemanasan dengan suhu tinggi, sterilisiasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf p
ada suhu 121˚C selama 15 menit. Untuk alat-alat yang terbuat dari gelas, disterilkan dengan menggunakan oven
suhu 16 0˚C selama 2 jam. Sedangkan alat-alat logam disterilkan dengan cara
dipijarkan menggunakan api spiritus Kumar, 2012.
3.3.2 Pembuatan Media 3.3.2.1 Pembuatan Media
Malt Extract Agar MEA
Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media MEA dibuat dengan cara MEA sebanyak 50 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuades. Media
tersebut dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer. Campuran media tersebut disterilisasi dalam
autoklaf pada suhu 121
o
C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Media dituang ke dalam cawan petri steril masing-masing ±10 mL dan biarkan hingga memadat.
3.3.2.2 Pembuatan Media Potato Dextrose Agar PDA
Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media PDA dibuat dengan cara PDA sebanyak 39 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media
tersebut dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer. Campuran media tersebut disterilisasi dalam
autoklaf pada suhu 121
o
C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Media dituang ke dalam cawan petri steril masing-masing ±10 mL dan biarkan hingga memadat.
3.3.2.3 Pembuatan Media Agar Miring PDA
Media agar miring PDA dibuat dengan cara PDA sebanyak 39 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media tersebut dicampur sampai merata
dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer. Campuran media tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing
sebanyak 5 mL lalu disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121
o
C, tekanan 1 atm
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
selama 15 menit. Setelah disterilisasi, tabung reaksi tersebut diletakkan dalam posisi miring ± 45
o
dan biarkan hingga memadat Jauhari, 2010.
3.3.2.4 Pembuatan Media Nutrient Agar NA
Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media NA dibuat dengan cara NA sebanyak 20 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media
tersebut dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate and stirrer. Campuran media tersebut disterilisasi dalam
autoklaf pada suhu 121
o
C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Media dituang ke dalam cawan petri steril masing-masing 10 mL dan biarkan hingga memadat.
3.3.2.5 Pembuatan Media Agar Miring NA
Media NA miring dibuat dengan cara NA sebanyak 20 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media tersebut dicampur sampai merata dengan cara
pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate and stirrer. Campuran media tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 mL lalu
disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121
o
C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah disterilisasi, tabung reaksi tersebut diletakkan dalam posisi miring ± 45
o
dan biarkan hingga memadat Jauhari, 2010
3.3.2.6 Pembuatan Media Potato Dextrose Yeast PDY Broth
Potato Dextrose Broth dan Yeast Agar masing-masing sebanyak 24 gram dan 2 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media tersebut dicampur
sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer. Sambil diaduk, kalsium karbonat CaCO
3
ditambahkan kedalam larutan hingga mencapai pH 6. Media tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada
suhu 121
o
C, tekanan 1 atm selama 15 menit Jauhari, 2010.
3.3.2.7 Pembuatan Media Nutrient Broth NB
Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media NB dibuat dengan cara NB sebanyak 8 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media
tersebut dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
menggunakan hot plate dan stirrer. Campuran media tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121
o
C, tekanan 1 atm selama 15 menit.
3.3.3 Isolasi Kapang Endofit
Kapang endofit diisolasi dari daun tanaman Syzygium cumini L. Daun yang digunakan adalah daun hijau muda dan daun hijau tua. Isolasi kapang
endofit dilakukan mengikuti metode Fisher et al., 1993 yang dimodifikasi. Sampel daun tanaman jamblang di cuci dengan air mengalir selama 10 menit.
Sampel daun yang telah dicuci kemudian disterilisasi permukaan dengan cara daun direndam ke dalam etanol 70 selama 1 menit, kemudian direndam ke
dalam larutan NaOCl 5,25 selama 5 menit, lalu direndam kembali ke dalam etanol 70 selama 30 detik, dan terakhir dibilas dengan akuadest steril selama 5
detik. Daun yang telah disterilisasi permukaannya diletakkan di atas kertas saring steril dan dibiarkan hingga kering di udara. Setelah kering, daun dipotong menjadi
bagian kecil dengan ukuran 1x1 cm
2
dengan pisau steril. Potongan sampel diletakkan pada cawan petri yang berisi media MEA.
Inokulasi sampel dilakukan triplo dan tiap cawan berisi 2 potongan daun. Selain itu pada akuadest bilasan terakhir diambil 1 mL dan diisolasi ke media MEA
lainnya, perlakuan ini berfungsi sebagai kontrol. Selama pekerjaan dilakukan di dalam laminar air flow dan kemudian media yang telah diinokulasi potongan
sampel dan media kontrol diinkubasi pada suhu 29
o
C selama 5 –21 hari tergantung
tingkat pertumbuhan kapang. Isolat endofit yang menunjukkan sifat morfologi jamur dipindahkan ke media MEA yang baru sampai diperoleh isolat murni.
3.3.4 Pemurnian Kapang Endofit
Kapang endofit yang telah tumbuh pada media isolasi MEA, kemudian secara bertahap dimurnikan satu persatu. Masing-masing isolat murni kapang
endofit yang diperoleh dipindahkan ke dalam media MEA plate lain. Pemurnian ini bertujuan untuk memisahkan koloni endofit dengan morfologi yang berbeda
untuk dijadikan isolat tersendiri. Pengamatan morfologi dilakukan kembali setelah inkubasi selama 5-7 hari, dan apabila masih ditemukan pertumbuhan koloni yang
berbeda secara makroskopik maka harus dipisahkan kembali sampai diperoleh
Kategori