Pemanfatan Isolat Lokal Analisa Permasalahan

ATCC 25923 bakteri gram positif yang tidak membentuk spora. Hasil pengujian aktivitas antagonistik bakteri asam laktat terhadap bakteri patogen ternyata isolat yang berasal dari badeg pace memiliki daya hambat yang tinggi dibandingkan dengan isolate dari buah mengkudu matang. Dalam penelitian ini tidak dilakukan identifikasi jenis senyawa antimikroba yang dihasilkan, akan tetapi dari beberapa penelitian telah membuktikan bahwa bakteri asam laktat dapat menghasilkan beberapa senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, misalnya, asam laktat, asam asetat, asam-asam organik, hidrogen peroksida, dan senyawa komplek protein spesifik yang disebut bakterosin adalah senyawa- senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat. Kelima isolat yang terpilih diseleksi kemampuannya menghambat bakteri patogen. Kemampuan penghambatan isolat Lactobacillus sp. JR64 dapat dilihat dari terbentuknya areal bening zone penghambatan di sekitar sumuran yang berisi isolat Lactobacillus sp. seperti pada Gambar 7. Gambar 7. Hasil Pengujian Anti Mikroba Lactobacillus sp. Pada Gambar 8. dapat dilihat bahwa Lactobacillus sp. JR17 dan Lactobacillus sp. JR10 memiliki aktifitas antibakteri yang sangat kecil yaitu 1,0 mm. Lactobacillus sp. JR64 memiliki aktivitas antibakteri yang paling besar 3,9 mm terhadap Escherichia coli ATCC 25922 dan 4,0 mm Staphylococcus aureus ATCC 25923, hampir sama dengan bakteri pembanding kontrol 4,0 mm terhadap Escherichia coli ATCC 25922 dan 4,2 mm terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923. Sedangkan kedua isolat yang lainnya Lactobacillus sp. JR19 dan Lactobacillus sp. JR92 memiliki aktifitas penghambatan 2,1 mm dan 3,0 mm terhadap Escherichia coli ATCC 25922, terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 seluas 2,9 mm dan 4,1 mm. Diameter hambat terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 Diameter hambat terhadap Escherichia coli ATCC 25922 44 Uji Kemampuan Tumbuh Pada Media Garam Empedu Untuk dapat bertahan dan tumbuh pada saluran pencernaan, bakteri asam laktat sebagai kultur probiotik harus mampu melewati berbagai kondisi lingkungan yang menekan. Salah satunya adalah pada saat bakteri dikonsumsi memasuki bagian atas saluran usus dimana empedu disekresikan ke dalam usus. Cairan empedu merupakan campuran dari asam empedu, kolesterol, asam lemak, fosfolipid, pigmen empedu dan sejumlah xenobiotik terdetoksifikasi. Sekresi pankreas juga mengandung serangkaian enzim pencernaan, dimana enzim yang bersifat lipolitik diaktifkan oleh karakteristik aktif permukaan empedu. Kombinasi tersebut bersifat bakterisidal bagi mikroorganisme komersial dalam tubuh manusia kecuali bagi beberapa genus penghuni usus yang tahan terhadap empedu. Garam empedu berpengaruh terhadap permeabilitas sel bakteri. Pada sel bakteri asam laktat yang diinkubasi pada larutan penyangga yang mengandung garam empedu masih mengalami pertumbuhan dan tidak mengalami lisis, tetapi mengalami peningkatan kebocoran materi intraseluler yang terabsorbsi pada panjang gelombang 260 nm, yang berarti terjadi perubahan sifat permeabilitas pada membran sel bakteri. Pada bakteri yang tidak tahan terhadap garam empedu diduga bahwa perubahan permeabilitas seluler dan kebocoran materi intraseluler yang dialami lebih besar sehingga menyebabkan lisisnya sel, Gambar 8. Hasil pengujian anti mikroba Lactobacillus sp. Simbol : E. Coli 25922 : S. aureus 25923 45 mengakibatkan kematian. Empedu bersifat sebagai senyawa aktif permukaan sehingga dapat menembus dan bereaksi dengan sisi membran sitoplasma yang bersifat lipofilik, menyebabkan perubahan dan kerusakan struktur membran. Sifat aktif permukaan empedu juga mengakibatkan aktifnya enzim lipolitik yang disekresikan oleh pankreas. Enzim tersebut juga mungkin bereaksi dengan asam lemak pada membran sitoplasma bakteri yang dapat mengakibatkan perubahan struktur membran dan sifat permeabilitasnya. Dari hasil seleksi didapatkan bahwa dua isolat yang berasal dari buah mengkudu matang Lactobacillus sp. JR17 dan Lactobacillus sp. JR10 tidak mampu tumbuh pada media yang mengandung garam empedu dengan konsentrasi 10 seperti Gambar 9 . Data pertumbuhan isolat pada berbagai konsentrasi garam empedu seperti pada Lampiran 10. Sedangkan tiga isolat Lactobacillus sp. JR64 dan Lactobacillus sp. JR19 serta Lactobacillus sp. JR92 yang berasal dari badag pace mampu tumbuh pada media yang mengandung garam empedu sampai konsentrasi 1 dan pertumbuhannya terhambat setelah konsentrasi garam empedu ditingkatkan 5 dan 10 , kemampuan ini lebih kecil dibandingkan bakteri pembanding kontrol yang mampu tumbuh sampai kadar garam empedu 10 . Meningkatnya konsentrasi garam empedu menyebabkan pertumbuhan isolat terhambat tidak mampu tumbuh hingga mencapai 85,5 untuk isolat yang bersumber Gambar 9. Kemampuan tumbuh isolat Lactobacillus sp. pada media garam empedu 10 . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Jum la h S el L og C fu m l Sumber Isolat Stater 10 Simbol : : Jumlah Sel Stater : Garam Empedu 10 46 mengkudu matang Lactobacillus sp. JR17. Sedangkan untuk isolat Lactobacillus sp. JR64 jumlah isolat yang tidak dapat bertahan relatif lebih kecil sebesar 65,4 dan mikroba kontrol sebesar 57,4. Kemampuan tumbuh pada pH rendah Kemampuan tumbuh pada pH rendah semakin menurun dengan semakin menurunnya pH media. Pada pH 3,5 semua isolat yang diperoleh masih mampu tumbuh 4 – 7 log cycle, kemudian pada pH 3 terjadi penurunan menjadi 3 - 6 log cycle, pada pH 2,5 turun lagi menjadi 2 – 5 log cycle dan pada pH 2 hanya Lactobacillus sp. JR64 dan kontrol yang masih mampu tumbuh sampai 3 log cycle, sedangkan yang lainnya hanya mampu tumbuh 1 log cycle. Pada Gambar 10 ditunjukkan bahwa pertumbuhan isolat yang berasal dari tuak mengkudu Lactobacillus sp. JR64 masih dapat tumbuh mencapai 1,1 x 10 5 Cfuml, sedangkan kontrol Lactobacillus bulgaricus FNCC41 pertumbuhannya mencapai 8 x 10 5 Cfuml. Jumlah mikroba yang tidak dapat bertahan pada pH 2,5 paling besar isolat yang bersumber dari BPB yang mengalami penurunan hingga 81,8 dari total stater yang diinokulasikan. Sedangkan untuk isolat yang bersumber dari badeg pace Lactobacillus sp. JR64 menurun 63,4 dan kontrol menurun 55,5 . Data pertumbuhan isolat pada berbagai pH dapat dilihat pada Lampiran 11. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 JR17 JR10 JR64 JR19 JR92 FNCC41 Jum la h Sel L og C fu m l Sumber isolat pertumbuhan pH 2,5 Starter pH 2,0 Simbol : : Jumlah Sel Stater : pH : 2,5 Gambar 10. Kemampuan tumbuh isolat Lactobacillus sp. pada media pH rendah. 47 Kebanyakan bakteri asam laktat tidak hanya mengalami pertumbuhan pada kondisi pH rendah, tetapi mungkin juga mengalami kerusakan asam dan hilangnya viabilitas sel. Pengaturan pH rendah dengan menggunakan HCl dalam media pertumbuhan, untuk mendekati kondisi lambung yang juga mengandung HCl. HCl adalah asam kuat yang mudah terdisosiasi menghasilkan proton menyebabkan penurunan pH medium di luar sel atau pH ekstraseluler. Paparan pada kondisi yang sangat asam dapat mengakibatkan kerusakan membran dan lepasnya komponen intraseluler yang dapat menyebabkan kematian. Bakteri asam laktat pada umumnya memiliki ketahanan yang lebih baik terhadap kerusakan membran akibat terjadinya penurunan pH ekstraseluler dibandingkan dengan bakteri yang tidak tahan terhadap asam. Perbedaan kerentanan terhadap kerusakan membran akibat turunnya pH telah diteliti oleh Bender et al., 1986, dimana kerusakan membran diukur berdasarkan pada keluarnya ion Mg dari sel. Pada galur yang kurang tahan terhadap asam, ion Mg akan keluar dari dalam sel ketika pH mencapai 4, sedangkan pada Lactobacillus casei mulai terjadi kerusakan membran pada pH eksternal kurang dari 3. Ada beberapa kemungkinan mekanisme bagaimana bakteri mengatur pH internalnya tetapi mekanisme yang paling penting adalah translokasi protron oleh enzim ATP-ase Hutkins dan Nannen 1993. Enzim yang terikat pada membran tersebut melakukan reaksi reversible bertindak sebagai pompa yang memindahkan ion. Enzim tersebut mengkatalisa gerakan proton melewati membran sel sebagai akibat dari hidrolisis atau sintesa ATP. Pada bakteri yang tahan asam, pH optimal enzim tersebut lebih rendah dibandingkan dengan yang kurang tahan terhadap asam. Parameter lain yang terlibat dalam pengaturan pH internal adalah permeabilitas membran plasma terhadap proton.

4.2.3. Identifikasi Lactobacillus sp. dengan Molekuler

Identifikasi molekuler Lactobacillus sp. dipilih dari hasil karakterisasi potensi isolat lokal terbaik yaitu Lactobacillus sp. JR64 dari badeg pace. Bakteri Lactobacillus sp. JR64 dilakukan identifikasi dengan menggunakan PCR yang diperkirakan akan berada pada daerah 16S rRNA. Isolasi Genom DNA Proses ekstrasi genom DNA dari isolat bakteri genus Lactobacillus sp. JR64 dilakukan secara enzimatis dengan menggunakan Instagene matrix, yaitu suatu kit yang dapat digunakan untuk ekstraksi genom DNA. Kit ini mengandung komponen yang 48 dibutuhkan dalam proses ekstraksi genom seperti lisozim, RNAse, dan EDTA. RNAse berfungsi untuk menguraikan RNA, karena keberadaan RNA dapat mengkontaminasi isolat DNA. Keberadaan protein dalam isolat DNA juga dapat mengganggu proses amplifikasi PCR, terutama jika protein tersebut adalah suatu DNAse yang dapat menguraikan DNA. Dari proses isolasi ini diperoleh DNA sebesar 1.360 ng dengan kemurnian 260280 2,5. Hasil isolasi ini mencukupi sebagai DNA templat, karena untuk proses amplifikasi PCR hanya diperlukan DNA sebesar 50-200 ngµl. Amplifikasi PCR pada daerah 16S rRNA Amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan primer 8F dan 1492R. Visualisasi hasil amplifikasi dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa dengan konsentrasi 1. Gambar 11. Hasil amplifikasi Gen 16S rRNA H as i l vi s u a l isasi seperti pada Gambar 11 m en unjukk a n p a nj a n g fr ag m e n a m pli ko n ya n g di p e r o l e h d a ri hasil P C R 16S r R NA diperkirakan sek i tar 1. 500 p b berdasarkan ukuran pita pada GeneRuler™ 1Kb DNA Ladder. H as il i ni m e nun j uk ka n b a h wa p a nj ang a mpli kon gen l6 S rRN A m e nd e k a ti d e n g an pr e d iks i : 1 484 pb j i ka meng g un a kan primer 8 F d an 1492R. 1500bp 1 2 Gen16S rRNA Keterangan : 1. GeneRuler™ 1Kb DNA Ladder 2. Amplikon gen 16S rRNA Isolat Lactobacillus sp. JR64 1.500 pb Skala GeneRuler™ 1Kb DNA Ladder 49