Uji in-vitro uji ketahanan Lactobacillus sp. pada pH rendah.
Metode dikembangkan dari modifikasi Zavaglia et al., 1998. Satu ose isolat Lactobacillus
sp. diinokulasikan ke dalam 5 ml media MRS broth, inkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Kemudian 1 inokulum dimasukkan ke dalam 5 ml MRS cair yang diatur
pHnya dengan variasi pH 3,5; pH 3,0; pH 2,5; dan pH 2,0. Pengaturan pH digunakan HCl. Inkubasi dilakukan pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Penghitungan jumlah bakteri dalam inokulum pada awal dan akhir inkubasi dilakukan dengan metode plating menggunakan
media MRS agar.
Uji in-vitro kemampuan tumbuh Lactobacillus sp. pada garam empedu.
Metode dikembangkan dari modifikasi Zavaglia et al., 1998. Satu ose isolat Lactobacillus
sp. diinokulasikan ke dalam 5 ml media MRS broth, inkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Kemudian 1 inokulum dimasukkan ke dalam media MRS cair dengan
penambahan garam empedu dengan variasi konsentrasi 0,5 ; 1,0 ; 5,0 ; dan 10,0 . Setelah diinkubasi selama 1 hari pada suhu 37
o
C dilakukan pengukuran Optical Density OD pada panjang gelombang 660 nm.
Uji in-vitro seleksi Lactobacillus sp. yang bersifat antimikroba.
Uji antimikroba dilakukan dengan metoda difusi sumur. Satu ose isolat Lactobacillus
sp. diinokulasikan ke dalam 5 ml media MRS broth, inkubasi pada suhu 37
o
C selama 48 jam. Satu ose bakteri penguji Escherichia coli ATCC 25922 dan Staphylococcus
aureus ATCC 25923 masing-masing diinokulasikan ke dalam 5 ml media Tryptone Soya
Broth , inkubasi pada suhu 29
o
C selama 24 jam. Sebanyak 0,1 inokulum bakteri penguji dimasukkan ke dalam medium Mueller Hinton agar steril suhu 45
o
C, kemudian dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan sampai padat. Kemudian dibuat lubang-lubang sumur
diameter 8 mm, lalu ke dalam masing-masing lubang dimasukkan 0,05 ml inokulum Lactobacillus
sp., diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 2 hari. Kemudian diukur area bening zone panghambatan yang terjadi.
32
Identifikasi molekuler Lactobacillus sp.
Tahapan kerja identifikasi molekuler Lactobacillus sp. secara umum dimulai dari ekstraksi genom DNA, kemudian amplifikasi PCR. Setelah itu, identifikasi molekuler
dilanjutkan dengan elektroforesis produk PCR dan purifikasi gel produk PCR. Setelah purifikasi gel produk PCR, diteruskan dengan amplifikasi PCR cycle sekuensing dan
selanjutnya sekuensing dan yang terakhir adalah tahapan analisis blast. Cara kerja identifikasi molekuler secara lengkap disajikan pada Lampiran 1.
3.3.2. Penelitian Tahap 2 : Kreasi Proses Pengumpulan data sekunder
Pengumpulan data sekunder dilakukan melalui penelusuran publikasi untuk mendapatkan data proses hasil dari penelitian yang telah dilakukan. Data-data hasil
penelusuran pustaka seperti konsentrasi substrat, suhu fermentasi, kecepatan pengadukan, dan galur untuk fermentasi selanjutnya digunakan sebagai referensi didalam melakukan
kreasi proses pada percobaan skala laboratorium 250 ml.
Percobaan proses fermentasi galur Lactobacillus sp. pada skala laboratorium 250 ml.
Proses fermentasi menggunakan isolat Lactobacillus sp. yang diperoleh dilakukan dengan tahapan peremajaan isolat Fardiaz, 1989, pembuatan starter Lactobacillus sp.
modifikasi Sulandari dkk., 2001 dan proses fermentasinya. Prosedur peremajaan isolat dan pembuatan starter Lactobacillus sp. disajikan pada Lampiran 4.
Proses fermentasi dilakukan pada skala laboratorium 250 ml dengan menggunakan substrat glukosa sebagai sumber karbon terdiri atas tiga taraf konsentrasi 20 gl, 30 gl, 40
gl. Komposisi media fermentasi dengan kandungan unsur mikro diantaranya : 5 gl Sodium asetat, 2 gl Amonium asetat, 2 gl Na2HPO4, 1 gl Tween 80, 0,1 gl
MgSO4.7H2O dan 0,05 gl MnSO4.5H, selanjutnya media ditambah air hingga 1.000 ml untuk setiap volume satu liter. Setelah dilakukan inokulasi maka kemudian diinkubasi
selama 48 jam pada suhu 37 C. Selama fermentasi dihitung jumlah sel bakteri dan
penimbangan bobot sel kering, kadar asam laktat, gula reduksi, protein dan asam linoleat pada jam ke-0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, dan jam ke 48.
33
Prosedur kerja yang digunakan untuk pengukuran kadar asam linoleat seperti pada Lampiran 2, sedangkan prosedur kerja pengukuran gula reduksi Miller, 1959 dan asam
laktat seperti pada Lampiran 3. Prosedur kerja pengukuran kadar protein metode Kjelhdal Sudarmadji et al., 1996
yang selanjutnya dikonversi menjadi kadar nitrogen, perhitungan jumlah sel bakteri secara SPC Fardiaz, 1989 yang dikonversi menjadi bobot sel gl dan pengukuran kadar asam
laktat AOAC, 1970 serta pengukuran pH Fardiaz, 1989 seperti pada Lampiran 5.
Sintesis proses fermentasi galur Lactobacillus sp. pada skala laboratorium 250 ml.
Sintesis proses dilakukan dengan cara mengkonfirmasi hasil penelitian yang pernah dilakukan oleh peneliti lain yang mempunyai kemiripan. Hasil dari sintesis proses
diharapkan dapat menentukan proses fermentasi yang terbaik dari hasil percobaan skala laboratorium 250 ml.
3.3.3. Penelitian Tahap 3 : Pengembangan Proses
Pembuatan diagram alir dan integrasi proses
Pembuatan diagram alir disusun berdasarkan hasil tahapan proses dari percobaan skala laboratorium 250 ml untuk kemudian dilakukan integrasi proses dari tahapan awal
hingga akhir. Hasil dari integrasi proses yang merupakan hasil percobaan terbaik selanjutnya di uji pada skala pilot plant 75 L.
Pengujian proses fermentasi curah dengan substrat glukosa skala pilot plant 75 L.
Proses fermentasi menggunakan isolat Lactobacillus sp. yang diperoleh dilakukan dengan tahapan peremajaan isolat Fardiaz, 1989, pembuatan starter Lactobacillus sp.
modifikasi Sulandari dkk., 2001 dan proses fermentasinya. Prosedur peremajaan isolat dan pembuatan starter Lactobacillus sp. disajikan pada Lampiran 4.
Proses fermentasi dilakukan pada skala pilot plant 75 L dengan menggunakan substrat glukosa sebagai sumber karbon. Konsentrasi dipilih dari hasil percobaan skala
laboratorium 250 ml yaitu 20 gl, 30 gl, 40 gl. Komposisi media fermentasi dengan kandungan unsur mikro diantaranya : 5 gl Sodium asetat, 2 gl Amonium asetat, 2 gl
Na2HPO4, 1 gl Tween 80, 0,1 gl MgSO4.7H2O dan 0,05 gl MnSO4.5H, selanjutnya 34
