dibutuhkan dalam proses ekstraksi genom seperti lisozim, RNAse, dan EDTA. RNAse berfungsi untuk menguraikan RNA, karena keberadaan RNA dapat mengkontaminasi isolat
DNA. Keberadaan protein dalam isolat DNA juga dapat mengganggu proses amplifikasi PCR, terutama jika protein tersebut adalah suatu DNAse yang dapat menguraikan DNA.
Dari proses isolasi ini diperoleh DNA sebesar 1.360 ng dengan kemurnian 260280 2,5. Hasil isolasi ini mencukupi sebagai DNA templat, karena untuk proses amplifikasi PCR
hanya diperlukan DNA sebesar 50-200 ngµl.
Amplifikasi PCR pada daerah 16S rRNA
Amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan primer 8F dan 1492R. Visualisasi hasil amplifikasi dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa dengan konsentrasi 1.
Gambar 11. Hasil amplifikasi Gen 16S rRNA
H as
i l
vi s
u a
l isasi seperti pada Gambar 11
m en
unjukk a
n p a
nj a
n g
fr ag
m e
n a
m pli
ko n
ya n
g di
p e
r o
l e
h d a
ri hasil P C
R 16S r R
NA diperkirakan sek i
tar 1.
500 p b berdasarkan ukuran pita
pada GeneRuler™ 1Kb DNA Ladder.
H as
il i ni m
e nun
j uk
ka n
b a
h wa p
a nj
ang a mpli
kon gen l6
S rRN A
m e
nd e
k a
ti d e
n g
an pr
e d
iks i : 1
484 pb
j i
ka meng
g un
a kan primer 8
F d
an 1492R.
1500bp 1 2
Gen16S rRNA
Keterangan :
1. GeneRuler™ 1Kb DNA Ladder 2. Amplikon gen 16S rRNA Isolat
Lactobacillus sp. JR64
1.500 pb
Skala GeneRuler™ 1Kb DNA Ladder
49
Penentuan Urutan Basa DNA Sekuensing daerah 16S rRNA
Penentuan urutan basa sekuensing hasil PCR dilakukan dengan menggunakan primer 765R dan 1141R. Hasil pembacaan urutan basa fragmen DNA sampel Lactobacillus
sp. JR64 menggunakan ABI 3130 Genetic Analyzer diperoleh sebanyak 945 bp, dapat dilihat pada Lampiran 12. Data hasil amplikon selanjutnya dibandingkan tingkat
homologinya dengan data hasil sekuensing gen bakteri yang terdapat pada data Genebank, menggunakan program BLAST-N. Hasil BLAST urutan nukleotida tersebut terhadap data
base 16S rDNA yang terdapat dalam situs
www.ncbi.com dapat dilihat pada Lampiran 13.
Berdasarkan analisis penjajaran dengan program Clustal X, maka diperoleh pohon kekerabatan filogenetik seperti Gambar 12. Analisis menunjukkan bahwa isolat
Lactobacillus sp. JR64 mempunyai kemiripan yang paling tinggi dengan Lactobacillus
plantarum strain UK-3 dengan nilai kesamaan pasangan basa max score 854, nilai total
pasangan basa total score 854, presentase analisis keseluruhan query coverage 100, persentase kesalahan dalam proses E value 0,0 dan presentase keakuratan identifikasi
max identify 99 . Dari hasil pembacaan pohon filogenetik diperoleh hasil bahwa isolat
yang berasal dari badeg pace merupakan jenis bakteri Lactobacillus plantarum JR64.
Gambar 12. Pohon filogenetik isolat Lactobacillus sp. JR64
50
Berdasarkan data pohon filogenetik isolat Lactobacillus sp. JR64 memiliki kesamaan dengan isolat Lactobacillus plantarum UK-3 yang ditemukan oleh Oh,K.H. and
Um,S.J., 2011, Lactobacillus plantarum strain UK-3 16S ribosomal RNA gene, www.ncbi..nlm.nih.govnucleotide
. Data secara detail Lactobacillus plantarum UK-3 ditunjukkan pada Lampiran 14.
4.2.4. Pemilihan bahan baku
Bahan baku yang digunakan untuk produksi probiotik penghasil omega-6 dan penurun kolesterol digunakan bahan baku ekstrak jagung dan ekstrak mengkudu. Harga
bahan baku untuk media fermentasi dari ekstrak jagung dan ekstrak mengkudu merupakan produk pertanian yang memiliki harga lebih murah dibandingkan dengan harga bahan baku
substrat yang berasal dari medium glukosa sehingga bahan baku dari produk pertanian direkomendasikan untuk digunakan sebagai bahan baku fermentasi produksi probiotik
penghasil omega-6 dan penurun kolesterol. Selisih harga bahan baku tersebut dapat memberikan keuntungan yang lebih besar.
Komposisi medium fermentasi yang digunakan dapat berupa medium sederhana atau medium komplek karena keduanya dapat diperoleh secara sintetis. Medium sintetis sangat
menguntungkan dimana untuk setiap komponen dapat dikurangi dihilangkan atau ditambahkan dan pada umumnya tidak membentuk busa karena tidak mengandung protein
dan peptida. Pada fermentasi skala industri sumber-sumber nutrien harus mampu membentuk produk atau biomassa dengan hasil maksimum untuk setiap gram substrat yang
digunakan. Manipulasi metabolik juga diharapkan dapat memacu pembentukan produk fermentasi dengan laju yang maksimum dan dapat menghambat pembentukan produk yang
tidak diinginkan. Aspek lain adalah medium fermentasi harus memiliki mutu yang konsisten, murah dan cukup tersedia sepanjang tahun serta tidak menimbulkan masalah
aerasi, agitasi dan pemurnian hasilnya Rachman, 1992. Manipulasi metabolik merupakan salah satu cara dalam teknik fermentasi untuk
memperoleh hasil yang optimum. Manipulasi metabolik dapat dilakukan dengan pemberian substrat media yang bervariasi baik jenis maupun konsentrasi. Pada lintasan primer
metabolik dapat ditemui beberapa senyawa antara yang membentuk lintasan samping. Dalam hal ini modifikasi metabolisme mikroorganisme dengan menggunakan peubah
variasi konsentrasi substrat diharapkan terjadi pembelokan lintasan metabolisme tersebut kearah pembentukan senyawa asam linoleat omega-6.
51
4.2.5. Pemilihan jalur proses
Masalah yang dihadapi dalam produksi probiotik dengan isolat lokal Lactobacillus plantarum
JR64 adalah besarnya efisiensi dari setiap tahapan proses karena akan berkorelasi dengan biaya produksi. Oleh sebab itu pemilihan jalur proses perlu dikaji secara detail
sehingga hasil perancangan dapat memberikan keuntungan secara maksimal. Dalam perancangan proses perlu dipertimbangkan efisiensi dan kesesuaian peralatan proses
sehingga pabrik memiliki umur yang panjang. Proses yang efisien sangat dipengaruhi oleh besarnya konversi bahan baku menjadi
produk yang diharapkan dengan konsumsi energi. Jika proses yang dipilih sangat efisien maka akan mampu memberikan keuntungan yang besar sehingga pengembalian modal
investasi bisa dilakukan lebih cepat. Sedangkan proses yang efektif sangat terkait dengan pemilihan peralatan yang tepat sehingga waktu proses lebih cepat, kondisi proses yang
aman dan mudah dalam pengoperasiannya. Faktor lain yang perlu diperhatikan dalam perancangan proses yaitu pemilihan jalur proses dengan tahapan yang singkat
dimungkinkan dapat memberikan keuntungan yang lebih besar karena semakin panjang tahapan proses akan menambah biaya pembelian peralatan dan membutuhkan tenaga
pengoperasi yang lebih banyak. Produksi probiotik penghasil omega-6
ω-6 dan penurun kolesterol dapat dilakukan dengan cara fermentasi menggunakan bahan baku glukosa maupun bahan baku subsitusi
dari ekstrak jagung dan ekstrak buah mengkudu. Sistem fermentasi dipilih fermentasi batch karena memiliki kelebihan seperti harga instrumentasi relatif lebih murah dan
penggunaannya fleksibel artinya dapat dihentikan secara mudah dan cepat setiap saat serta dapat digunakan secara multifungsi. Pemilihan sistem batch telah mempertimbangkan
selama proses fermentasi diharapkan Lactobacillus plantarum JR64 tidak menghasilkan zat toksin karena tidak dapat dikeluarkan yang dapat mengganggu metabolisme sehingga
produktivitas akan menurun. Fermentasi batch setelah dilakukan inokulasi tidak dilakukan lagi penambahan media ke dalam fermentor, sehingga semakin lama waktu fermentasi, laju
pertumbuhan spesifik μ mikroba semakin menurun sampai akhirnya berhenti. Penurunan
dan berhentinya pertumbuhan disebabkan nutrien berkurang dan terjadi akumulasi metabolit yang mempengaruhi laju pertumbuhannya, sehingga pada fermentasi curah jumlah sel pada
fase stasioner merupakan jumlah sel maksimum dan faktor pembatas utama dari luar terhadap pertumbuhan mikroba adalah konsentrasi nutrien dan konsentrasi metabolit-
metabolit dapat menghambat pertumbuhan mikroba. 52
