Waktu dan Tempat Alat dan Bahan Rancangan Penelitian Analisis Data

BAB 3 BAHAN DAN METODE

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2010 sampai Juli 2011 di Laboratorium Struktur Perkembangan Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara Medan.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah timbangan digital Preset Counter akurasi 0,01g, split 1ml dan 3 ml, jarum gavage, bak bedah, dissecting set, kaca arloji, jarum pentul, pisau silet goal, botol winkler, gelas ukur 1000ml, tube 14ml, hemositometer, counter, blender, panci, freezer sanyo, hot plate cimarec 2, kamera digital, mikroskop, cover glass, objek glass, dan kertas label. Bahan yang digunakan adalah mencit Mus musculus L. jantan, Testosteron Undekanoat TU 1000g4ml Buatan Schering AG Jerman, Coeleum ricini, NaCl 0,9 , biji pepaya Carica papaya L., aquabidestilata 500 ml, Vitamin C 50g.

3.3 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang didesain mengikuti Rancangan Acak Lengkap RAL. Penelitian ini terdiri dari 7 kelompok perlakuan yang masing-masing memiliki kontrol. Setiap kelompok terdiri dari 5 ulangan n=5. Penelitian ini berlangsung selama 36 minggu dimana pada minggu ke-0 hingga minggu ke-24 diberikan pemberian ekstrak air biji papaya Carica papaya L. setiap Universitas Sumatera Utara harinya dan Testosteron Undekanoat TU setiap 6 minggu sekali. Pada minggu ke-24 hingga minggu ke-36 dilakukan pemulihan dengan memberikan asupan Vitamin C setiap harinya. Tabel 3.1 Rancangan Penelitian RAL Minggu Kelompok 6 12 18 24 30 36 Kontrol K0 n=5 K1 n=5 K2 n=5 K3 n=5 K4 n=5 K5 n=5 K6 n=5 Perlakuan P0 n=5 P1 n=5 P2 n=5 P3 n=5 P4 n=5 P5 n=5 P6 n=5

3.4 Pelaksanaan Penelitian

3.4.1 Pemeliharaan Hewan Percobaan

Penelitian ini menggunakan mencit Mus musculus L. jantan yang sehat dan fertil serta berumur 8-11 minggu dengan berat 24-26 g sebanyak 70 ekor, mencit tersebut diperoleh dari Balai Penyidikan Penyakit Hewan Sumatera Utara Medan dan dibagi dalam kelompok perlakuan dan kontrol. Mencit diberi makan dan minum secara ad- libitum Mangkoewidjojo Smith, 1988. Kandang mencit dijaga kebersihan dan kenyamanannya. Penanganan hewan percobaan sesuai dengan persyaratan kode etik yang berlaku. Diantaranya penanganan dengan penuh kasih sayang, pemberian makanan yang cukup gizi dan sehat serta memperhatikan kebersihan kandangnya. Sebelum penelitian dilakukan diajukan permohonan untuk mendapatkan ethical clearance ke Komisi Etik Penelitian Hewan di Wilayah Sumatera Utara Medan. 3.4.2 Pembuatan Ekstrak Air Biji Pepaya Prosedur ini dilakukan berdasarkan Ilyas 2001 Ekstrak air pepaya disiapkan dengan mengumpulkan buah pepaya yang berasal dari Kelurahan Kemenangan Tani, Kecamatan Medan Tuntungan, Komplek Adam Malik, Kotamadya Medan, Sumatera Utara. Biji pepaya diambil dan dikeringkan dengan inkubator dengan suhu 50 o C ± 3 hari sampai kering. Biji yang telah kering dimasukkan ke dalam blender lalu dihaluskan hingga diperoleh bubuk halus biji pepaya. Ditimbang bubuk yang telah Universitas Sumatera Utara halus sebanyak 30g kemudian dimasukkan ke dalam bejana yang telah berisi air, selanjutnya dilakukan perebusan hingga mendidih dengan suhu 90 C. Setelah mendidih hasil rebusan disaring dengan kertas saring hingga diperoleh hasil dan residu. Residu yang diperoleh direbus kembali, hingga diperoleh hasil dan residu lagi begitu seterusnya sampai residu tidak dapat dipergunakan kembali. Hasil rebusan dipanaskan hingga diperoleh reindaimen, reindaimen yang dihasilkan kemudian dilarutkan kembali dengan aquabidestilata 500ml, sesuai dengan kebutuhan penelitian.

3.4.3 Uji Skrinning Fitokimia Biji Pepaya

Uji skrinning fitokimia biji pepaya yang akan dilakukan meliputi pemeriksaan kandungan senyawa flavanoid, alkaloid, steroid dan terpenoid. Pemeriksaan senyawa ini sesuai dengan prosedur yang telah dilakukan oleh Harborne 1987 yaitu: a. Uji Flavanoid Sebanyak 3g biji papaya yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan dan dimasukk- an ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml methanol. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi FeCl 3 1, tabung II ditetesi MgHCl, tabung III ditetesi H 2 SO 4 dan tabung IV ditetesi NaOH 10 . Masing – masing tabung sebanyak 3-5 tetes. Kemudian diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat hasilnya. b. Uji Alkaloid Sebanyak 3g biji papaya yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan dan dimasukk- an ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml metanol. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Meyer, tabung II ditetesi pereaksi Wagner, tabung III ditetesi pereaksi Bouchard dan tabung IV ditetesi pereaksi Dragendorf. Masing-masing tabung sebanyak 3-5 tetes. Kemudian diamati endapan yang terbentuk dan dicatat hasilnya.

c. Uji Steroid

Universitas Sumatera Utara Sebanyak 3g biji papaya yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan dan dimasukk- an ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml n- heksan. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO 4 1, tabung II ditetesi reagen Salkowsky H 2 SO 4p , tabung III ditetesi Libermen-Bouchard. Masing – masing tabung sebanyak 3-5 tetes. Kemudian diamati perubahan warna dan dicatat hasilnya. d. Uji Terpenoid Sebanyak 3g biji papaya yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan dan dimasukk- an ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml kloroform. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO 4 1, tabung II ditetesi reagen Salkowsky H 2 SO 4p , tabung III ditetesi Libermen-Bouchard. Masing – masing tabung sebanyak 3-5 tetes. Kemudian diamati perubahan warna dan dicatat hasilnya.

3.4.4 Pemberian Kombinasi Testosteron Undekanoat TU dan Ekstrak Air Biji

Pepaya Carica papaya L. Pemberian Kombinasi Testosteron Undekanoat TU dan Ekstrak Biji Pepaya Carica papaya L. diberikan dengan membandingkan dosis pada manusia. Perbandingan berat relawan 50 kg=50.000 g dengan mencit adalah 25 g adalah 2000:1. Pada uji klinik digunakan 500 mg TU, maka dosis penyuntikan pada tiap ekor mencit adalah 12000x500 mg TU = 0,25mg TU Moeloek et al., 2004; Ilyas, 2007. Sedangkan ekstrak air biji pepaya 30 mg0,5mlhari25 g berat badan mencit Ilyas, 2001. Interval waktu injeksi intramuskular TU 6 minggu dan pencekokan ekstrak air biji pepaya setiap hari. Kondisi penelitian terdiri dari tujuh 7 bagian perlakuan dan kontrol. Dosis ekstrak air biji pepaya didasarkan pada dosis optimum penelitian Ilyas, dkk 2001 yakni 30 mg0,5mlhari25 g BB mencit. Ulangan ditetapkan dengan rumus t-1n-1 ≥ 15 Federer, 1963, dimana t = perlakuan, dan n = ulangan sehingga didapatkan ulangan sebanyak 5 kali. Penggunaan dosis TU didasarkan pada Universitas Sumatera Utara penelitian sebelumnya yang merekomendasikan pemakaiannya yakni 0,25 mg25 g BB mencit6 minggu Moeloek et al., 2008; Ilyas, 2007. Perlakuan penyuntikan TU dan pencekokan ekstrak air biji pepaya ditampilkan dalam bentuk skema pada Gambar 5 berikut. Injeksi TU 2,5mgekor interval 6 minggu Catatan : Pembedahan dilakukan setiap enam minggu sekali Gambar 3.1 Jadwal Kegiatan Pemberian TU+Ekstrak Air Biji papaya selama 36 minggu

3.4.5 Pemberian Vitamin C

Buletin super nutrition 2002 menyatakan bahwa asupan asam askorbat Vitamin C yang dapat dikomsumsi oleh manusia berkisar antara 150-1500 mg. Pemberian Vitamin C ini dirancang jumlahnya dengan membandingkan dosis yang diberikan pada manusia. Setiap tablet Vitamin C mengandung 50 mg, Adapun cara pemberian dosisnya dimana 4 tablet Vitamin C 200mg dikonversikan dengan berat badan antara mencit Mus musculus jantan dengan manusia yakni 25g50.000g atau setara dengan 12000 x 4 tablet = 42000 = 1500 x 50 = 0,1 mg mencit. 6 12 18 24 30 36 Pencekokan ekstrak biji papaya 30mgekormencit jantan setiap hari Interval minggu Pencekokan Vitamin C sebanyak 0,5 mlekorhari Universitas Sumatera Utara 3.5 Parameter Pengamatan 3.5.1 Jumlah Sperma Dilakukan pembedahan terhadap mencit Mus musculus L. kemudian dipotong bagian cauda epididimis dan distal vas deferens. Selanjutnya cauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi NaCl 0,9 , kemudian dilakukan pemotongan dengan pisau silet goal biasa, lalu suspensi sperma yang telah homogen diambil dengan pipet tetes 50µL lalu dimasukkan ke dalam kotak hemositometer Improved Neubauer, kemudian dilihat dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali. Gambar 3.2 Kamar Hitung Improved Neubauer Zaneveld et al., 1986 Pengamatan jumlah sperma dilakukan menurut Soehadi dan Arsyad 1983, Hasil perhitungan dimasukkan ke dalam rumus: Jumlah sperma = N2 x 10 5 Dimana, N = Jumlah sperma yang dihitung dalam kotak. spermatozoaml suspensi

3.5.2 Morfologi Sperma

Universitas Sumatera Utara Diambil sperma dari cauda epididimis dan dibuat sediaan hapus pada kaca objek, kemudian dikeringkan. Diberi pewarnaan giemsa selama 15 menit. Setelah itu diamati dengan mikroskop cahaya kemudian dihitung jumlah sperma, lalu ditentukan persentase jumlah sperma yang normal dan abnormal. Untuk mendapatkan hasil akhirnya, jumlah persentase sperma yang normal kiri dan kanan cauda epididimis dijumlah kemudian diambil rata-ratanya. Ciri sperma normal yaitu mempunyai bentuk kepala seperti kait pancing dan ekor panjang lurus, sedangkan sperma yang abnormal mempunyai bentuk kepala tidak beraturan, dapat berbentuk seperti kepala tidak beraturan, dapat berbentuk seperti pisang, atau tidak beraturan amorphus, atau terlalu bengkok, dan ekornya tidak lurus bahkan tidak berekor, atau hanya terdapat ekornya saja tanpa kepala WHO, 1988. Sperma normal Sperma Normal = x 100 100 spermatozoa normalabnormal

3.5.3 Viabilitas sperma

Pemeriksaan viabilitas spermatozoa dilakukan pemberian warna giemsa pada hemositometer. Spermatozoa yang hidup tidak berwarna dan yang mati berwarna kemudian dilakukan pengamatan dengan mikroskop cahaya pada pembesaran 400x dan dihitung terhadap 100-200 spermatozoa. Sebagai hasilnya dinyatakan dalam bentuk persen hidup yang didapat dari hasil bagi jumlah spermatozoa hidup dengan jumlah total spermatozoa hidup dan mati yang dikalikan dengan 100 WHO, 1988. s permatozoa hidup Sperma Hidup = x 100 100 spermatozoa hidupmati 3.5.4 Motilitas sperma Suspensi sperma yang diperoleh terlebih dahulu dibiarkan selama 5 menit pada suhu kamar selanjutnya suspensi ini diteteskan pada kamar hitung Improved Neubauer, diamati dibawah mikroskop dengan melihat dan menghitung jumlah spermatozoa yang bergerak cepat, tidak bergerak, dan bergerak lamban WHO, 1988. Universitas Sumatera Utara

3.6 Analisis Data

Data yang didapat dari setiap parameter variabel pengamatan dicatat dan disusun ke dalam bentuk tabel. Data kuantitatif variabel dependen yang didapatkan, diuji kemaknaannya terhadap pengaruh kelompok perlakuan variabel independen dengan bantuan program statistik komputer yakni program SPSS release 13. Urutan uji diawali dengan uji normalitas, uji homogenitas, Untuk keputusan uji statistik diambil pada taraf nyata 5 p = 0,05 untuk melihat perbedaan dua perlakuan dilakuan dengan uji t paramatrik atau Mann-Whitney non-paramatrik. Universitas Sumatera Utara

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Jumlah spermatozoa