3.6.2 Pembuatan Media Agar
11,5 gram nutrient agar dilarutkan dalam 500 mL akuades lalu dipanaskan sampai mendidih selama ± 40 menit. Setelah itu disterilkan
dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
3.6.3 Kultur Bakteri
Butiran cryo Escherichia coli yang berasal dari microbank dengan suhu -80
C dimasukkan ke dalam media cair Buffered Peptone Waters BPW. Kemudian inkubasi di dalam inkubator selama 24 jam dengan
suhu 37
o
C.
3.6.4 Prosedur Ekstraksi
Proses ekstrasi madu karet menggunakan metode ekstrak cair-cair. Dengan perbandingan madu : pelarut sebanyak 1 : 1. Ambil madu
karet sebanyak 50 mL. Kemudian madu karet dimasukan kedalam masing-masing corong pisah A dan B. Lalu tambahkan pelarut 50 mL
aseton pada corong pisah A dan 50 mL n-heksan pada corong pisah B. Setelah itu corong pisah dikocok selama 3 jam dengan shaker. Lalu
pindahkan dari corong pisah A ke gelas beker C dan corong pisah B ke gelas beker D untuk dilakukan pemisahan secara sempurna antara madu
karet dan pelarut selama 12 jam. Lalu hasil ekstrak madu karet dengan pelarut yang sudah didiamkan selama 12 jam pada gelas beker C dan D
kemudian dikeluarkan dan dipisahkan menggunakan pipet lalu diletakkan pada gelas beker E, F, G, H. Kemudian dipekatkan
menggunakan oven dengan suhu 80
o
C. Keterangan Lampiran 5 :
1. Corong pisah A : campuran madu karet + aseton
2. Corong pisah B : campuran madu karet + n-heksan
3. Gelas beker C : hasil ekstrak madu karet + aseton
4. Gelas beker D : hasil esktrak madu karet + n-heksan
5. Gelas beker E : residucairan hasil ekstrak madu karet + aseton
6. Gelas beker F : sedimenendapan hasil ekstrak madu karet + aseton
7. Gelas beker G : residu cairan hasil ekstrak madu karet + n-heksan
8. Gelas beker H : sedimenendapan hasil ekstrak madu karet +
n-heksan
3.6.5 Pembuatan Variabel Konsentrasi
Uji antibakteri dengan madu karet tanpa ekstraksi dan ekstrak madu karet dengan variasi konsentrasi yang disesuaikan dengan penelitian
sebelumnya yaitu 20 , 25 , 50 , 100 dan kontrol positif menggunakan antibiotik amoksisilin 25 ug. Sedangkan kontrol negatif
menggunakan pelarut aseton dan n-heksan.
Keterangan : n = volume zat terlarut Sehingga peneliti menggunakan volume zat terlarut saat konsentrasi
20, 25, 50, dan 100 berturut-turut yaitu 1 mL, 1,25 mL, 2,5 mL, dan 5 mL.
3.6.6 Metode
disk diffusion
Ambil kultur dalam BPW Buffered Peptone Water menggunakan pipet sebanyak 1 mL lalu masukkan ke dalam masing-masing cawan
petri kemudian campur dengan nutrien agar sebanyak 15-20 mL. Kemudian blank disk direndam didalam wadah yang berisi
residusedimenasetonn-heksanmadu karet selama 15 menit. Kemudian blank disk yang sudah terendam serta antibiotic disk amoksisilin 25 ug
diletakkan di cawan petri yang sudah berisi biakan murni bakteri Escherichia coli. Lalu diinkubasi didalam inkubator dengan suhu 37
o
selama 24 jam. Kemudian disk akan berdifusi pada media nutrient agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan
pada mikroorganisme di permukaan media nutrient agar. Kemudian Konsentrasi
Volume zat terlarut Volume zat terlarut + volume pelarut
100 X
=
Kategori