Beberapa metode yang biasa digunakan untuk mendenaturasi protein adalah Bruice, 1998.
a. Mengubah pH.
Misalnya dengan penambahan asam kuat seperti asam trikloroasetat TCA. Mekanisme denaturasi protein akibat perubahan pH oleh asam trikloroasetat
adalah dengan mengubah muatan anion-kation pada berbagai ikatan protein sehingga terjadi gangguan elektrostatik dan rusaknya ikatan hidrogen protein.
b. Reagen-reagen khusus seperti urea dan guanidin hidroklorida akan membentuk
ikatan hidrogen dengan protein yang bersifat lebih kuat daripada ikatan antarprotein dalam molekul tersebut sehingga protein terdenaturasi.
c. Detergen-detergen seperti natrium dodesil sulfat dan pelarut-pelarut organik
berikatan dengan gugus non polar sehingga mengganggu ikatan hidrofobik normal.
d. Panas dapat mendenaturasi protein dengan meningkatkan pergerakan molekul
protein yang mengganggu gaya tarik menarik antarmolekul protein.
G. Kolorimetri
1. Definisi
Kolorimetri merupakan teknik pengukuran serapan cahaya yang diabsorpsi oleh zat berwarna, baik warna dari zat asal maupun warna yang terbentuk akibat
reaksi dengan zat lain Khopkar, 1990. Pada kolorimetri, dibuat kadar larutan dengan kadar yang semakin meningkat serta membandingkan warnanya dengan
senyawa yang hendak dianalisis. Menurut Roth and Blaschke 1981, kolorimetri PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
juga mencakup pengubahan senyawa yang tidak berwarna menjadi berwarna dan penentuan fotometrinya dilakukan pada panjang gelombang sinar tampak 400-800
nm. Pemilihan prosedur kolorimetri didasarkan pada pertimbangan sebagai
berikut Bassett, Denney, Jeffery, and Mendham, 1991 : 1.
Metode kolorimetri memberikan hasil yang lebih akurat pada konsentrasi rendah daripada titrimetri atau gravimetri.
2. Metode kolorimetri sering digunakan pada kondisi di mana metode titrimetri atau gravimetri tidak dapat dilakukan.
3. Metode kolorimetri memiliki beberapa keuntungan untuk penentuan sejumlah
komponen dalam sampel yang sama.
2. Metode penetapan kadar parasetamol secara kolorimetri
Ada beberapa macam cara yang dapat digunakan pada metode kolorimetri untuk penetapan parasetamol.
a. Teknik asam nitrat.
Parasetamol dilarutkan dengan metanol dan ditambah dengan larutan asam nitrat sehingga menghasilkan warna kuning kemerahan Connors, 1982.
OH NHCOCH
3
HNO
3
OH NHCOCH
3
NO
2
Gambar 6. Reaksi parasetamol dengan asam nitrat Connors, 1982
b. Teknik hidrolisis menjadi p-aminofenol.
Pembentukan senyawa berwarna dari parasetamol umumnya diawali dengan hidrolisis parasetamol menjadi p-aminofenol. Hasilnya lalu direaksikan dengan
o -nitroanilin terdiazotasi, vanilin, p-dimetilaminobenzaldehid atau 2-naftol yang
dalam suasana basa akan membentuk senyawa berwarna Belal, Elsayed, El- Waliely, and Abdine, 1979.
NHCOCH
3
OH H
+
H
2
O
OH NH
2
+
CH
3
COOH
parasetamol p-aminofenol
asam asetat
Gambar 7. Reaksi hidrolisis parasetamol menjadi p-aminofenol Belal et al., 1979
Penetapan kadar parasetamol dalam plasma dengan metode ini tanpa disertai dengan pemisahan parasetamol dari konjugatnya akan memberikan hasil yang
tidak sesuai dengan kadar yang sebenarnya Belal et al., 1979. c.
Metode Chafetz et al. 1971. Parasetamol yang telah dilarutkan aquadest ditambah dengan larutan asam
klorida 6N, natrium nitrit 10, asam sulfamat 15 dan NaOH 10 akan menghasilkan warna kuning. Cincin aromatis dari parasetamol akan dinitritasi
oleh asam nitrit menjadi 2-nitro-4-asetamidofenol. Dalam suasana basa, larutan akan memiliki kromofor yang yang lebih panjang sehingga serapan dapat terbaca
pada panjang gelombang 430 nm Chafetz, Daly, Schriftman, and Lomner, 1971.
NHCOCH
3
OH
NaNO
2
HCl OH
NHCOCH
3
NO
2
OH -
O
NHCOCH
3
NO
2
Gambar 8. Reaksi pembentukan warna pada metode Chafetz et al. 1971
Metode ini sangat spesifik untuk parasetamol meskipun dipengaruhi oleh salisilat Chamberlain, 1995. Asam salisilat akan memberikan reaksi yang mirip dengan
parasetamol, tetapi di dalam plasma, asam salisilat baru akan memberi intensitas warna yang mirip dengan 20
μgml parasetamol jika kadar asam salisilat di dalam plasma 1000
μgml Widdop, 1986. d.
Penetapan kadar parasetamol dalam plasma. Sebanyak 2,0 ml asam trikloroasetat ditambahkan ke dalam 1,0 ml plasma lalu
disentrifugasi dan diambil supernatannya. Kemudian supernatan dicampur dengan 1,0 ml asam klorida 6N dan 2,0 ml natrium nitrit 10 dan didiamkan
selama 2 menit. Lalu ditambahkan 2,0 ml asam sulfamat secara hati-hati dan 5,0 ml natrium hidroksida 10. Serapan diukur pada panjang gelombang
430 nm dengan air tanpa reagen sebagai blangkonya. Reaksi ini spesifik untuk parasetamol dan tidak dipengaruhi oleh konjugat sulfat dan konjugat glukuronida
parasetamol Glynn and Kendal, 1975. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
H. Desain
