Analisis PAH Ekstraksi dan

Daging dibakar dengan formula bumbu, lama, dan jarak pemanasan menurut rancangan RSM Pisahkan Daging Sampel dari Tulang Homogenisasi dengan Food Processor Ambil 1 g daging Campurkan dengan 1 mL NaOH 1 M Tambahkan dengan Ekstrelut 1.75 g Masukkan ke dalam Kolom PRS dengan kapasitas 6 mL Fraksi PAH diuapkan dengan N 2 Elusi dengan 12 mL Diklorometan: Toluen 5 Larutkan dengan 1 mL n-heksana Masukkan dalam kolom berisi Silika gel teraktivasi Elusi dengan 10 mL n-heksana : diklorometan 60 : 40 PAH diuapkan dengan N 2 Larutkan dalam 1 mL acetonitril Uapkan acetonitril dengan N 2 Larutkan dalam 200 µL standar PAH 2.5 µgmL Analisis [PAH] dengan HPLC-UV Gambar 5 Diagram alir ekstraksi PAH dari sampel daging modifikasi Janoszka et al. 2004 27

4. PEMBAHASAN

4.1 Validasi Metode Ekstraksi PAH dengan Tandem SPE dan HPLC

Validasi metode merupakan salah satu penunjang dalam mendapatkan data hasil penelitian yang valid. Hal ini dikarenakan dengan melakukan validasi metode, atribut-atribut dalam suatu metode seperti ketelitian, ketepatan, sensitivitas, dan keterulangan dapat terlihat dan dapat dioptimalkan. Validasi metode biasa dilakukan apabila metode yang digunakan dalam suatu pengujian atau penelitian merupakan metode yang benar-benar baru atau apabila telah dilakukan modifikasi pada metode yang telah divalidasi. Selain itu, validasi metode juga dilakukan pada pengujian senyawa dengan konsentrasi trace seperti PAH untuk melihat validitas dari data yang dilaporkan. Pada penelitian ini dilakukan modifikasi pada metode ekstraksi polisiklik aromatik hidrokarbon PAH yang telah dikembangkan oleh Janoszka et al. 2004. Modifikasi dilakukan pada jumlah sampel yang digunakan serta jumlah pelarut yang digunakan dimana pada penelitian ini jumlah sampel yang digunakan hanya 1 gram dengan jumlah pelarut yang telah disesuaikan. Selain itu digunakan instrumen High Performance Liquid Chromatography HPLC dengan detektor UV untuk mendeteksi keberadaan PAH, berbeda dengan metode Janoszka et al. 2004 yang menggunakan HPLC dengan detektor fluoresens dan kromatografi gas dengan detektor mass spectrophotometer. Detektor UV dipilih karena detektor ini merupakan detektor yang umum terdapat pada lembaga pengujian pangan di Indonesia sehingga metode ini diharapkan dapat diaplikasikan oleh lembaga pengujian di Indonesia untuk pengukuran PAH dalam pangan. Validasi metode yang dilakukan pada penelitian ini mengikuti standar EURACHEM 1998 yang meliputi uji kesesuaian sistem, linieritas, LOD dan LOQ instrumen, uji recovery dan uji keterulangan. Hasil validasi metode ekstraksi PAH dengan menggunakan tandem SPE dan HPLC-UV terdapat pada Tabel 6. Tabel 6 Hasil validasi metode ekstraksi PAH dengan tandem SPE dan HPLC-UV Kriteria Nilai untuk BAP Nilai Untuk DBA Linearitas injeksi standar PAH murni R 2 , range konsentrasi 0.05-10 µgmL 0.999 0.999 Linearitas metode dengan standar adisi dalam sampel R 2 , range spiking 0.1-10 µgg sampel 0.968 0.960 Uji Kesesuaian Sistem RSD 2 - RSD luas area - RSD waktu retensi 0.78 1.44 0.57 1.60 Limit Deteksi LOD 7.4 ngg sampel 6.6 ngg sampel Limit Kuantifikasi LOQ 24.7 ngg sampel 22.0 ngg sampel Rekoveri dengan spiking 5 µgg sampel 104.21 101.18 Repeatability atau Presisi 23.66 20.85 Hasil uji kesesuaian sistem untuk benzoapiren BAP dan dibenzoa,hantrasen DBA ditunjukkan pada Tabel 6. Rata-rata waktu retensi untuk BAP dan DBA masing-masing adalah 11.448 menit dan 13.232 menit dengan RSD di bawah 2. Sementara rata-rata luas area BAP dan DBA adalah 179.5855 dan 347.9346 dengan RSD di bawah 2. Hasil ini sesuai dengan standar RSD yang disarankan oleh JECFA untuk prosedur analisis trace. Kromatogram hasil analisis PAH dapat dilihat pada Gambar 6. Peak dari BAP tampak pada 12.634 menit dan DBA pada 13.511 menit. Peak dari kedua jenis PAH ini tampak sebagai peak yang terpisah sehingga analisis dari kedua PAH dapat dilakukan secara simultan. Uji linearitas dilakukan dengan injeksi standar benzoapiren dan dibenzoa,hantrasen ke dalam sampel ikan rebus. Hasil uji linearitas untuk BAP dan DBA ditunjukkan pada Tabel 6. Luas area peak meningkat secara proporsional seiring dengan meningkatnya konsentrasi BAP dan DBA yang di- spike ke dalam matriks sampel daging ikan rebus. Hasil uji linearitas metode analisis BAP dan DBA dengan adisi standar ke dalam sampel pada range konsentrasi spike 0.1-10 µgg sampel memiliki nilai koefisien determinasi R 2 di bawah 0.990. Sementara koefisien regresi injeksi langsung standar BAP dan DBA di atas 0.990. Nilai uji linearitas injeksi langsung standar PAH sesuai dengan yang disarankan EURACHEM 1998, yaitu nilai koefisien determinasi R 2 0.990. Hasil uji LOD dan LOQ PAH menunjukkan nilai LOD dari HPLC untuk BAP adalah 7.4 ngg sampel dan untuk DBA 6.6 ngg sampel. Sementara nilai LOQ untuk BAP adalah 24.7 ngg sampel dan untuk DBA adalah 22.0 ngg sampel. Nilai ini lebih kecil dibandingkan yang dilaporkan oleh Farhadian et al. 2011 dan Janoszka et al. 2004 untuk analisis BAP menggunakan HPLC dengan detektor fluoresens. Nilai LOD yang dihasilkan peneliti ini untuk BAP adalah 0.01-0.03 ngg. Hal ini menunjukkan detektor fluoresens lebih sensitif untuk deteksi PAH dalam sampel . Penyebab lainnya adalah tidak digunakannya kolom khusus untuk analisis PAH seperti yang dilakukan oleh kedua peneliti tersebut. Kolom khusus PAH merupakan kolom yang berisi C 18 dan ultra-high purity silika yang khusus dibuat untuk kolom PAH. Silika ini memiliki kemampuan sangat baik untuk mereduksi adsorpsi dari molekul polar sehingga jumlah senyawa pengganggu interferens sedikit dan resolusi pemisahan masing- masing PAH menjadi lebih baik. Upaya yang dilakukan untuk meningkatkan deteksi metode pada penelitian ini adalah dengan adisi standar pada tahap akhir ekstraksi PAH. Dalam metode yang dikembangkan oleh Janoszka et al. 2004, pada tahap akhir residu yang mengandung PAH dilarutkan dalam 200 µL Acetonitril : Air 80:20. Modifikasi dilakukan dengan mengganti penambahan Acetonitril : Air dengan standar PAH BAP dan DBA dengan konsentrasi 2.5 µgmL sebanyak 200 µL. Dengan melakukan adisi standar PAH pada ekstraksi jumlah PAH yang terdeteksi akan masuk ke dalam limit deteksi dari sistem HPLC yang digunakan pada penelitian. Hasil uji recovery dan uji keterulangan untuk analisis BAP dan DBA ditunjukkan pada Tabel 6. Konsentrasi standar BAP dan DBA yang di-spiking ke dalam matriks sampel ikan rebus adalah 5 µgg sampel. Hasil uji recovery pada standar BAP bervariasi antara 69.32-128.61 dengan rata-rata recovery adalah 104.21. Sementara hasil uji recovery pada standar BAP bervariasi antara 59.54-121.23 dengan rata-rata recovery adalah 101.19. Nilai ini sesuai dengan nilai yang direkomendasikan oleh EURACHEM 1998 yaitu 80-110 untuk analisis kandungan trace dalam sampel dengan konsentrasi 5 µgmL. Nilai recovery yang dihasilkan pada penelitian ini lebih baik dibandingkan hasil penelitian Riverra et al. 1996 yang menggunakan tandem SPE dan HPLC-UV untuk analisis PAH. Peneliti ini melaporkan nilai recovery untuk analisis BAP dan DBA pada matriks sampel daging bakar masing-masing sebesar 47 dan 64. Selain nilai recovery yang lebih baik, penggunaan sampel dalam jumlah rendah merupakan keunggulan dari metode analisis yang diterapkan dalam penelitian ini. Hasil uji keterulangan analisis PAH ditunjukkan oleh nilai RSD dari masing-masing analisis PAH. Nilai keterulangan untuk BAP adalah 23.66 sedangkan untuk DBA adalah 20.85. Nilai ini di atas batas keberterimaan yang disarankan oleh AOAC untuk analisis trace yait u nilai RSD ≤ 15. Untuk mengatasi hal ini optimasi proses ekstraksi SPE dapat dilakukan dengan menggunakan vacuum chamber yang dapat mengatur laju alir pelarut yang digunakan. Riverra et al. 1996 menyebutkan bahwa laju alir yang optimum untuk mendapatkan recovery yang baik adalah 0.5 mLmenit. Gambar 6 Kromatogram analisis PAH dengan HPLC-UV pada sampel yang dispike standar campuran BAP dan DBA masing-masing 1 µgg sampel.

4.2 Analisis Respon Optimasi Pembakaran

Hasil pengukuran respon pada percobaan proses pembakaran ikan dan ayam panggang diperlihatkan pada Tabel 7 dan Tabel 8. Hasil dari uji coba pendahuluan digunakan sebagai faktor percobaan dalam desain percobaan Box-Behnken pada BAP DBA