merancang percobaan agar mendapatkan hasil paling optimum dari percobaan tersebut Montgomery 2001.
Metode RSM umum digunakan untuk optimasi proses kimia maupun biokimia seperti optimasi reaksi enzimatis, optimasi formula dalam pembuatan
roti, optimasi proses ekstraksi zat tertentu dari matriks pangan, dan juga optimasi proses untuk reduksi komponen berbahaya seperti akrilamid Lasekan Abbas
2011; Mestadagh et al 2008. Lasekan dan Abbas 2011 melakukan optimasi kondisi pemanggangan dengan menggunakan RSM-central composite design
CCD pada kacang almond untuk menurunkan kandungan akrilamid dari kacang almond tersebut. Mestadagh et al. 2008 melakukan optimasi proses blansir
dengan RSM dengan desain CCD pada kentang untuk mereduksi akrilamid yang terbentuk pada produk olahan kentang goreng. Kedua peneliti tersebut berhasil
melakukan optimasi proses pengolahan dengan RSM untuk menurunkan akrilamid yang terbentuk pada produk pangan.
Optimasi proses untuk mereduksi PAH dengan RSM pada makanan belum banyak dilaporkan. Penelitian hanya sebatas pada optimasi metode ekstraksi PAH
dengan metode LC-MS maupun microwave-assisted dengan bantuan RSM seperti yang dilaporkan oleh Ramalhosa et al. 2012 dan Gonzalez et al. 2007. Contoh
penelitian optimasi reduksi PAH adalah penelitian yang dilakukan Ghevariya et al. 2011 yang meneliti tentang komposisi media pertumbuhan yang optimum
dengan bantuan RSM bagi bakteri Achronobacter cylosoxidians untuk mereduksi chrysene. Penelitian optimasi proses pemasakan untuk reduksi PAH
pada makanan belum pernah dilakukan sebelumnya.
3. METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2011 sampai Maret 2012. Penelitian ini dilakukan di beberapa laboratorium yaitu, Laboratorium Kimia
Pangan, SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Analisis Pangan Departemen ITP, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel makanan berupa daging ayam bagian dada dengan berat per unit sampel 300 g, ikan bawal dengan
berat per ekor 300 g, bumbu kuning terdiri atas kunyit, lengkuas, bawang putih, bawang merah, kemiri, merica, garam, dan jahe yang digunakan untuk penyiapan
ayam panggang dan ikan bakar, standar komponen PAH, yaitu benzoapiren BAP dan dibenzoa,hantrasen DBA, asetonitril HPLC-grade, diklorometan
p.a., toluena, n-heksana p.a., akuades Mili-Q grade, NaOH, kolom solid phase extraction, yaitu kolom ekstrelut Merck
®
diatomaceus earth, kolom PRS propylsulphonic acid silica dari SiliCycle
®
SiliCycle Inc. Canada, dan silica gel for HPLC Merck
®
. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan gelas, pipet
volumetrik, pipet mikro, alat pemanggang dengan menggunakan arang briket untuk penyiapan ikan bakar dan ayam panggang, food processor. Sedangkan
peralatan yang digunakan untuk analisis PAH adalah instrumen HPLC Agilent 1200 series dengan detektor MWD merk Agilent yang diset pada panjang
gelombang UV Agilent Technologies, USA dan kolom ODS C18 dengan panjang 15cm, diameter 4.6 mm dan ukuran partikel 5 µ m.
3.3 Tahapan Penelitian
Penelitian dilakukan dalam tiga tahapan seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3. Tahapan pertama adalah validasi metode analisis PAH secara
simultan untuk BAP dan DBA dengan tandem SPE dan HPLC meliputi uji linearitas, uji kesesuaian sistem, penentuan limit of detection LOD, penentuan
limit of quantification LOQ, akurasi uji recovery, dan uji repeatability. Tahapan
kedua dan ketiga adalah optimasi proses pembuatan ikan bakar dan ayam panggang yang rendah kandungan PAH dengan melakukan pengujian pada
kombinasi konsentrasi bumbu yang digunakan, jarak pemanasan, dan lama
pemanasan
3.4 Tahap Pertama: Validasi Metode Ekstraksi PAH
Validasi metode analisis polycyclic aromatic hydrocarbon PAH dilakukan dengan cara melakukan uji linearitas dengan standar adisi dalam sampel,
penentuan limit of detection LOD, penentuan limit of quantification LOQ, uji kesesuaian sistem, akurasi uji recovery, dan uji presisi atau repeatabilty dengan
mengikuti metode EURACHEM 1998. Validasi dilakukan pada metode analisis yang dimulai dari tahap ekstraksi dengan SPE hingga analisis PAH dengan
menggunakan HPLC-UV.
3.4.1 Uji linearitas
Uji linearitas dilakukan dengan analisis hasil ekstraksi larutan standar PAH pada matriks pangan yang di-spiking dengan 7 konsentrasi PAH berbeda. Larutan
standar PAH
yang digunakan
adalah benzoapiren
BAP dan
dibenzoa,hantrasen DBA. Linearitas diukur dengan menggunakan nilai R
2
yang didapat dari plot antara luas area peak dari HPLC-UV dengan konsentrasi dalam ppm atau µgmL untuk masing-masing BAP dan DBA. Nilai linearitas
yang diharapkan adalah lebih dari 0.990.
3.4.2 Limit of detection dan limit of quantification instrumen
Nilai limit of detection LOD dan limit of quantification LOQ instrumen ditentukan dengan menggunakan standar BAP dan DBA. Dilakukan enam
penentuan dengan injeksi menggunakan konsentrasi 2 ugmL kemudian diinjeksikan ke HPLC-UV. Hasil pengukuran kemudian diplotkan ke dalam kurva
standar masing-masing untuk BAP dan DBA yang didapatkan dengan cara injeksi langsung standar PAH. Standar deviasi SD dari keenam penentuan
tersebut dihitung. Nilai LOD alat dinyatakan sebagai 3 kali standar deviasi, sedangkan LOQ adalah 10 kali standar deviasi.
3.4.3 Uji kesesuaian sistem
Uji kesesuaian sistem ditentukan dengan cara melakukan enam kali injeksi standar dengan konsentrasi tertentu dari larutan standar BAP dan DBA ke dalam
sistem HPLC-UV. Larutan standar BAP dan DBA yang digunakan adalah 2 ppm. Kemudian dihitung standar deviasi dan standar deviasi relatif RSD dari waktu
retensi dan luas area hasil pengukuran dengan menggunakan HPLC-UV. Nilai standar deviasi relatif yang diperbolehkan menurut JECFA adalah 2.
3.4.4 Uji recovery dan repeatabilty
Uji recovery dilakukan dengan menggunakan sampel ayam panggang dan ikan bakar yang di-spike ditambahkan dengan larutan standar Benzoapiren
BAP dan Dibenzoa,hantrasen DBA pada konsentrasi yang telah diketahui. Konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini adalah 5 µgg atau 5 ppm.
Percobaan spiking dilakukan sebanyak 7 ulangan. Sampel yang di-spiking ini kemudian mengalami proses ekstraksi dan clean up sama seperti sampel tanpa
spiking dan dianalisis kandungan PAH dengan HPLC-UV. Recovery dari metode dapat dihitung dengan rumus:
Recovery = konsentrasi yang ditemukan – konsentrasi tanpa spiking x 100
konsentrasi spiking Dari 7 ulangan yang didapat, dihitung rata-rata recovery dan standar deviasi relatif
RSD. Nilai RSD ini digunakan sebagai repeatability dari metode ekstraksi.
3.5 Tahap Kedua: Optimasi kombinasi
variasi pembumbuan,
lama pemanasan, dan jarak pemanasan terhadap kandungan
PAH ikan bakar Formulasi bumbu ikan bakar dilakukan dengan menggunakan bumbu
kuning yang sudah umum digunakan oleh pedagang ikan dan ayam panggang. Pembuatan ikan bakar dilakukan dengan menggunakan alat pemanggang dengan
sumber panas dari briket batu bara. Penentuan kombinasi konsentrasi bumbu, jarak pemanasan dan lama pemanasan dilakukan dengan menggunakan desain
response surface methodology RSM dengan variabel independen seperti terlihat pada Tabel 2. Presentase bumbu merupakan perbandingan konsentrasi bumbu
dengan berat basah daging ikan maupun ayam.
