8. Penetapan Kadar
a. Penyiapan Sampel. Sebanyak dua buah wadah yang berisikan media dari
serbuk kayu dimasukkan cacing Lumbricus rubellus 1 kg untuk setiap wadah dan diberikan perlakuan yaitu pemberian pangan daun tercemar
timbal Pb yang diperoleh dari pohon di jalan Godean, Yogyakarta. Kemudian daun-daun ini disemprotkan dengan PbNO
3
10µgml secara merata dan difermentasi selama seminggu menggunakan cairan EM4
®
. Pemberian pangan dilakukan semenjak cacing Lumbricus rubellus berumur
2 minggu hingga 2 bulan. Dimana pemberian pangan dilakukan setiap 6 kali sehari.
b.
Preparasi Sampel. Sebanyak sejumlah cacing lalu direndam didalam air
panas. Jika cacing tidak bergerak lagi diangkat dari wadah lalu dikering
anginkan.
c. Destruksi Basah. Ditimbang seksama dua setengah gram sampel bobot
kering, dalam labu Erlenmeyer 50 ml sebelumnya dicuci asam dan dikeringkan. Ditambahkan 7,5 ml H
2
SO
4
pekat diikuti oleh 12,5 ml HNO
3
pekat ke dalam labu sampel. Sampel dipanaskan menggunakan hotplate pada suhu ±130°C mendidih. Ketika dipanaskan akan keluar asap cokelat-
kuning. Setelah asap cokelat-kuning tersebut hilang, maka akan mucul asap putih dari H
2
SO
4
yang menunjukkan terjadinya proses penguraian H
2
SO
4
dan sampel akan berwarna lebih gelap. Dengan segera ditambahkan HNO
3
pekat setetes demi setetes. Dilanjutkan sampai warna larutan menjadi jernih, yaitu berwarna kuning jerami. Jika larutan itu masih gelap warnanya
ditambahkan HNO
3
pekat perlahan-lahan dan dididihkan lagi. Proses ini diulangi sampai larutan tersebut jernih, kuning jerami dan ketika
dimasukkan kedalam wadah yang berisi es tidak terbentuk gumpalan minyak. Sampel dibiarkan mendingin sampai suhu kamar dilakukan dua
kali replikasi AOAC, 2007. d.
Penyaringan. Penyaringan dilakukan dengan menggunakan corong burner dan Kertas Whatman No. 42. Kertas Whatman No. 42 dijenuhkan dengan
HNO
3
1 M lalu diletakkan di bagian atas corong. Corong diletakkan pada mulut labu isap. Sebanyak 5 ml HNO
3
1 M dituangkan ke dalam erlenmeyer yang berisi timbal hasil destruksi basah lalu disaring. Kedalam Erlenmeyer
kosong dibilas dengan 5 mL HNO
3
1 M sebanyak 2 kali untuk mengantipasi sampel tertinggal di Erlenmeyer. Sebanyak 5 ml HNO
3
1 M dituangkan ke dalam labu isap melewati kertas saring tadi untuk mengantisipasi adanya
sampel yang tertinggal di kertas saring dan corong. Larutan hasil penyaringan dipindahkan ke dalam labu ukur 50 mL kemudian ditambahkan
HNO
3
1 M hingga batas tanda pada labu ukur. Larutan dipindahkan ke wadah plastic dan disimpan dalam lemari pendingin. Larutan siap diujikan
ke SSA pada kondisi optimum dilakukan dua kali replikasi AOAC, 2007.
e. Penetapan Kadar. Larutan hasil destruksi diujikan ke SSA dengan kondisi
optimum dan diukur absorbansinya dengan panjang gelombang λ 217 nm.
Lalu dihitung kadarnya dan dibuat kurva antara peningkatan kadar timbal dalam cacing Lumbricus rubellus dan waktu.
G. Tata Cara Analisis Hasil
1. Validasi Alat Untuk Determinasi
a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi r yang diperoleh
dari kadar dan serapan dari data penentuan kurva baku ke dalam regresi linear.
b. Sensitivitas. Sensitivitas alat dapat ditentukan dengan menghitung LOD
dengan rumus:
Keterangan: Sa : standar deviasi dari intercept kurva baku dan b : slope
2. Validasi Metode
a. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus:
Perolehan Kembali recovery = x 100
b. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus:
Kesalahan Acak RSD = c.
Intermediate Precision. Kesesuain alat ditentukan dengan uji-t terhadap slope dan intersept dari 2 kurva baku yang dibaca pada hari yang berbeda.
d. Limit of Quantitation. Limit Of Quantitation LOQ dapat dihitung dengan
rumus:
Keterangan: Sa : standar deviasi dari intercept kurva adisi dan b : slope
Kategori