Pembuatan Kurva Absorbansi Metronidazol Pembuatan Kurva Kalibrasi Metronidazol Uji Pelepasan Metronidazol dari Sediaan Film Uji Bioadhesif secara In Vitro

3.7 Uji Sifat Pengembangan

Derajat pengembangan DP film ini dilakukan dalam dua pendekatan, yaitu berdasarkan pertambahan berat dan pertambahan luas film. Ditimbang berat awal W 1 dan diukur lebar dan panjang dari film, ke dalam wadah disolusi dimasukkan 900 ml larutan medium lambung buatan pH 1,2 dan diatur suhu 37 ± 0,5 o C dengan kecepatan pengadukan alat disolusi yaitu 100 rpm. Kemudian dimasukkan sediaan film alginat- kitosan yang mengandung metronidazol. Pada interval waktu 10, 15, 30, 60, 120, 180, 240 dan 300 menit sampel yang basah ditarik keluar dengan hati-hati dan diusap antara kertas filter untuk menghilangkan kelebihan air dari permukaan, ditimbang kembali W2 dan diukur lebar dan panjangnya. Derajat pengembangan diukur dalam jumlah relatif air yang diserap terhadap massa awal. Setiap pengujian diulangi 3 kali percobaan. Daya pengembangan dihitung sebagai berikut: Pengembangan = W2-W1 ------------ X 100 W1

3.8 Pembuatan Kurva Absorbansi Metronidazol

Dibuat Larutan Induk Baku LIB dengan cara melarutkan 25 mg metronidazol dalam medium lambung buatan hingga 100 ml 200 ppm. Setelah itu dipipet 1,2 ml LIB lalu dicukupkan hingga 25 ml dengan medium lambung buatan pH 1,2. Diukur menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 200-400 nm.

3.9 Pembuatan Kurva Kalibrasi Metronidazol

Dibuat larutan metronidazol dengan berbagai macam konsentrasi, yaitu: 1; 2; 4; 6; 8; 10; 12; 14; 16 ppm dengan cara melarutkan 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ; 1; 1,2; 1,4; 1,6 ml LIB dan dicukupkan hingga 25 ml dengan medium lambung buatan. Masing-masing Universitas Sumatera Utara konsentrasi diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 277,3 nm

3.10 Uji Pelepasan Metronidazol dari Sediaan Film

Uji pelepasan metronidazol menggambarkan jumlah metronidazol yang terlepas dari sediaan film dan ditentukan secara Spektrofotometri Ultra Violet UV. Dimasukkan 900 ml medium lambung buatan pH 1,2 ke dalam labu disolusi, kemudian diatur suhu medium 37 ± 0,5 o C. Dimasukkan kapsul yang mengandung sediaan film ke dalam wadah sampel dan secara bersamaan diaduk dengan kecepatan 100 rpm. Kemudian pada waktu 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 370, 400, 430, 460, 490, 510, 540, 560, 600, 630, 660, 690, 720 menit, dicuplik 2 ml larutan dari dalam wadah sampel, dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml dan dicukupkan dengan akuades sampai garis tanda, kemudian ditentukan secara Spektrofotometri Ultra Violet . Kadar metronidazol ditentukan secara Spektrofotometri Ultra Violet pada panjang gelombang 277,3 nm. Kemudian ditentukan persen pelepasan metronidazol dari sediaan film.

3.11 Uji Aktivitas Antibakteri Film

Disiapkan Film Metronidazol dengan teknik aseptik. Disterilisasi alat-alat yang diperlukan dalam pengujian aktivitas antibakteri.

3.11.1 Sterilisasi alat dan bahan

Universitas Sumatera Utara Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan didalam oven pada suhu 170°C selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset dengan lampu bunsen. 3.11.2 Pembuatan media 3.11.2.1 Media Nutrient Agar NA Komposisi : ‘Lab-Lemco” powder 1 g Yeast extract 2 g Peptone 5 g NaCl 5 g Agar 15 g Air suling sampai 1 L pH : 7,4 ± 0,2 pada suhu 25 o C Cara pembuatan: Sebanyak 28 g serbuk NA dilarutkan dalam air suling hingga 1 liter dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Oxoid, 2013.

3.11.2.2 Media Nutrient Broth NB

Komposisi : ‘Lab-Lemco’ Powder 1 g Yeast extract 2 g Peptone 5 g NaCl 5 g Air suling sampai 1 L pH : 7,4 ± 0,2 pada suhu 25 o C Universitas Sumatera Utara Cara pembuatan: Sebanyak 13 g serbuk NB dilarutkan dalam air suling hingga 1 liter dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Oxoid, 2013.

3.11.2.3 Media Muller Hington Agar MHA

Komposisi: Beef extract 3 g Peptone 5 g Sodium Cloride 5 g Agar 15 -20 g Destiled water 1000 ml pH : 7.4 ± 0,2 Cara pembuatan: Sebanyak 38 g serbuk MHA dilarutkan dalam air suling hingga 1 liter dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit.

3.11.3 Pembuatan stok kultur S. aureus

Biakan bakteri S. aureus diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanam pada media nutrient agar miring dengan cara menggores. Kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36-37 o C selama 18-24 jam Depkes RI, 1995. 3.11.4 Penyiapan inokulum bakteri Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril lalu disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml Nutrient Broth. Kemudian diukur Universitas Sumatera Utara kekeruhan larutan pada panjang gelombang 580 nm sampai diperoleh transmitan 25 Depkes RI, 1995.

3.11.5 Pembuatan kurva larutan standar metronidazol

Larutan standar metronidazol dibuat dalam berbagai konsentrasi 0-200 µg dengan melarutkan metronidazol menggunakan air suling. Masing-masing konsentrasi dimasukkan ke dalam vial. Kedalam cawan petri dimasukkan 0,1 ml inokulum, kemudian ditambahkan 15 ml media MHA steril yang telah dicairkan dan ditunggu hingga suhu mencapai 45 o C, dihomogenkan dan dibiarkan sampai media memadat. Dimasukkan pencadang kertas ke dalam masing-masing larutan dan dibiarkan selama 30 menit. Selanjutnya ke dalam petri dimasukkan pencadang kertas yang telah dicelupkan dengan larutan dan ditiriskan dengan jarak 5 cm. Diinkubasi pada suhu 36- 37 o C selama 18-24 jam. Selanjutnya diameter daerah hambat di sekitar sumur diukur dengan menggunakan jangka sorong. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali.

3.11.6 Pengujian aktivitas antibakteri film

Larutan yang diperoleh dari hasil disolusi juga dilakukan pengujian aktivitas antibakterinya dengan metode difusi agar. Pada interval wakru 0;0,5;1;2;3;4;5;6;7;8;9;10;11;12 jam diambil 2 ml aliquot disolusi, lalu dimasukkan ke dalam vial, Tambahkan 2 ml medium lambung buatan kedalam labu disolusi setiap pengambilan aliquot disolusi. Kedalam cawan petri dimasukkan 0,1 ml inokulum, kemudian ditambahkan 15 ml media MHA steril yang telah dicairkan dan ditunggu hingga suhu mencapai 45 o C, dihomogenkan dan dibiarkan sampai media memadat. Dimasukkan pencadang kertas ke dalam masing-masing larutan disolusi dan dibiarkan Universitas Sumatera Utara selama 30 menit.. Selanjutnya ke dalam petri dimasukkan pencadang kertas yang telah dicelupkan dengan larutan dan ditiriskan dengan jarak 5 cm. Diinkubasi pada suhu 36- 37 o C selama 18-24 jam. Selanjutnya diameter daerah hambat di sekitar sumur diukur dengan menggunakan jangka sorong.. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali.

3.12 Uji Bioadhesif secara In Vitro

Alat untuk uji bioadhesif dirakit secara lokal menggunakan tensiometer Du- Noey yang dimodifikasi, prinsipnya adalah mengukur kekuatan bioadhesif dinilai dalam hal kekuatan tarikan dynecm yang dibutuhkan untuk melepaskan kontak antara sediaan film alginat-kitosan dengan jaringan mukosa. Pada alat ini diatur bagian wadah tempat sampel sebagai tempat plat film, dan pada ujung kawat pengait di tempatkan jaringan mukosa lambung yang ditempelkan pada pelat. Uji dilakukan menggunakan jaringan mukosa lambung tikus. Tikus dikorbankan dengan cara dislokasi leher. Jaringan mukosa lambung dibuka sepanjang kurvatura mayor, dicuci dengan NaCl fisiologis dan diequilibrasi pada 37 ± 0,5 o C dalam asam lambung buatan pH 1,2 selama 10 menit sebelum uji bioadhesif. Jaringan mukosa lambung dipotong kira-kira 1 x 1 cm dan ditempelkan pada pelat akrilat, pelat akrilat dikaitkan dengan kawat penarik tensiometer dengan mukosa lambung menghadap ke bagian bawah. Pada sisi tempat sampel dipasang film alginat-kitosan ukuran 2 x 5 cm yang telah dikondisikan dalam medium lambung buatan pH 1,2 selama 10 menit sebelumnya. Kemudian keduanya diposisikan secara bersentuhan dengan tekanan konstan selama 5 menit. Setelah 5 menit, pengait ditarik ke atas dengan memutar penarik tensiometer sampai kontak antara film dan jaringan terlepas. Gaya Universitas Sumatera Utara dynecm 2 yang dibutuhkan untuk melepaskan antara film dan jaringan diamati pada skala tensiometer dan dicatat. Pengujian ini dilakukan tiga kali ulangan.

3.13 Scanning Electron Microscopy SEM