3.7 Uji Sifat Pengembangan
Derajat pengembangan DP film ini dilakukan dalam dua pendekatan, yaitu berdasarkan pertambahan berat dan pertambahan luas film. Ditimbang berat awal W
1
dan diukur lebar dan panjang dari film, ke dalam wadah disolusi dimasukkan 900 ml larutan medium lambung buatan pH 1,2 dan diatur suhu 37 ± 0,5
o
C dengan kecepatan pengadukan alat disolusi yaitu 100 rpm. Kemudian dimasukkan sediaan film alginat-
kitosan yang mengandung metronidazol. Pada interval waktu 10, 15, 30, 60, 120, 180, 240 dan 300 menit sampel yang basah ditarik keluar dengan hati-hati dan diusap antara
kertas filter untuk menghilangkan kelebihan air dari permukaan, ditimbang kembali W2 dan diukur lebar dan panjangnya. Derajat pengembangan diukur dalam jumlah
relatif air yang diserap terhadap massa awal. Setiap pengujian diulangi 3 kali percobaan. Daya pengembangan dihitung sebagai berikut:
Pengembangan = W2-W1
------------ X 100 W1
3.8 Pembuatan Kurva Absorbansi Metronidazol
Dibuat Larutan Induk Baku LIB dengan cara melarutkan 25 mg metronidazol dalam medium lambung buatan hingga 100 ml 200 ppm. Setelah itu dipipet 1,2 ml
LIB lalu dicukupkan hingga 25 ml dengan medium lambung buatan pH 1,2. Diukur menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.9 Pembuatan Kurva Kalibrasi Metronidazol
Dibuat larutan metronidazol dengan berbagai macam konsentrasi, yaitu: 1; 2; 4; 6; 8; 10; 12; 14; 16 ppm dengan cara melarutkan 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ; 1; 1,2; 1,4; 1,6
ml LIB dan dicukupkan hingga 25 ml dengan medium lambung buatan. Masing-masing
Universitas Sumatera Utara
konsentrasi diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 277,3 nm
3.10 Uji Pelepasan Metronidazol dari Sediaan Film
Uji pelepasan metronidazol menggambarkan jumlah metronidazol yang terlepas dari sediaan film dan ditentukan secara Spektrofotometri Ultra Violet UV.
Dimasukkan 900 ml medium lambung buatan pH 1,2 ke dalam labu disolusi, kemudian diatur suhu medium 37 ± 0,5
o
C. Dimasukkan kapsul yang mengandung sediaan film ke dalam wadah sampel dan secara bersamaan diaduk dengan kecepatan
100 rpm. Kemudian pada waktu 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 370, 400, 430, 460, 490, 510, 540, 560, 600, 630, 660, 690, 720 menit,
dicuplik 2 ml larutan dari dalam wadah sampel, dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml dan dicukupkan dengan akuades sampai garis tanda, kemudian ditentukan secara
Spektrofotometri Ultra Violet .
Kadar metronidazol ditentukan secara Spektrofotometri Ultra Violet pada panjang gelombang 277,3 nm. Kemudian ditentukan persen pelepasan
metronidazol dari sediaan film.
3.11 Uji Aktivitas Antibakteri Film
Disiapkan Film Metronidazol dengan teknik aseptik. Disterilisasi alat-alat yang diperlukan dalam pengujian aktivitas antibakteri.
3.11.1 Sterilisasi alat dan bahan
Universitas Sumatera Utara
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan didalam oven pada suhu 170°C
selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset dengan lampu bunsen.
3.11.2 Pembuatan media 3.11.2.1 Media
Nutrient Agar NA
Komposisi : ‘Lab-Lemco” powder 1 g
Yeast extract 2 g
Peptone 5 g
NaCl 5 g
Agar 15 g
Air suling sampai 1 L
pH : 7,4 ± 0,2 pada suhu 25
o
C Cara pembuatan: Sebanyak 28 g serbuk NA dilarutkan dalam air suling hingga 1 liter
dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Oxoid, 2013.
3.11.2.2 Media Nutrient Broth NB
Komposisi : ‘Lab-Lemco’ Powder 1 g
Yeast extract 2 g
Peptone 5 g
NaCl 5 g
Air suling sampai 1 L
pH : 7,4 ± 0,2 pada suhu 25
o
C
Universitas Sumatera Utara
Cara pembuatan: Sebanyak 13 g serbuk NB dilarutkan dalam air suling hingga 1 liter dengan
bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Oxoid, 2013.
3.11.2.3 Media Muller Hington Agar MHA
Komposisi: Beef extract 3 g
Peptone 5 g
Sodium Cloride 5 g
Agar 15 -20 g
Destiled water 1000 ml
pH : 7.4 ± 0,2
Cara pembuatan: Sebanyak 38 g serbuk MHA dilarutkan dalam air suling hingga 1 liter dengan
bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
3.11.3 Pembuatan stok kultur S. aureus
Biakan bakteri S. aureus diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanam pada media nutrient agar miring dengan cara menggores. Kemudian diinkubasi
dalam inkubator pada suhu 36-37
o
C selama 18-24 jam Depkes RI, 1995. 3.11.4 Penyiapan inokulum bakteri
Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril lalu disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml Nutrient Broth. Kemudian diukur
Universitas Sumatera Utara
kekeruhan larutan pada panjang gelombang 580 nm sampai diperoleh transmitan 25 Depkes RI, 1995.
3.11.5 Pembuatan kurva larutan standar metronidazol
Larutan standar metronidazol dibuat dalam berbagai konsentrasi 0-200 µg dengan melarutkan metronidazol menggunakan air suling. Masing-masing konsentrasi
dimasukkan ke dalam vial. Kedalam cawan petri dimasukkan 0,1 ml inokulum, kemudian ditambahkan 15 ml media MHA steril yang telah dicairkan dan ditunggu
hingga suhu mencapai 45
o
C, dihomogenkan dan dibiarkan sampai media memadat. Dimasukkan pencadang kertas ke dalam masing-masing larutan dan dibiarkan selama
30 menit. Selanjutnya ke dalam petri dimasukkan pencadang kertas yang telah dicelupkan dengan larutan dan ditiriskan dengan jarak 5 cm. Diinkubasi pada suhu 36-
37
o
C selama 18-24 jam. Selanjutnya diameter daerah hambat di sekitar sumur diukur dengan menggunakan jangka sorong. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali.
3.11.6 Pengujian aktivitas antibakteri film
Larutan yang diperoleh dari hasil disolusi juga dilakukan pengujian aktivitas antibakterinya
dengan metode
difusi agar.
Pada interval
wakru 0;0,5;1;2;3;4;5;6;7;8;9;10;11;12 jam diambil 2 ml aliquot disolusi, lalu dimasukkan ke
dalam vial, Tambahkan 2 ml medium lambung buatan kedalam labu disolusi setiap pengambilan aliquot disolusi. Kedalam cawan petri dimasukkan 0,1 ml inokulum,
kemudian ditambahkan 15 ml media MHA steril yang telah dicairkan dan ditunggu hingga suhu mencapai 45
o
C, dihomogenkan dan dibiarkan sampai media memadat. Dimasukkan pencadang kertas ke dalam masing-masing larutan disolusi dan dibiarkan
Universitas Sumatera Utara
selama 30 menit.. Selanjutnya ke dalam petri dimasukkan pencadang kertas yang telah dicelupkan dengan larutan dan ditiriskan dengan jarak 5 cm. Diinkubasi pada suhu 36-
37
o
C selama 18-24 jam. Selanjutnya diameter daerah hambat di sekitar sumur diukur dengan menggunakan jangka sorong.. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali.
3.12 Uji Bioadhesif secara In Vitro
Alat untuk uji bioadhesif dirakit secara lokal menggunakan tensiometer Du- Noey yang dimodifikasi, prinsipnya adalah mengukur kekuatan bioadhesif dinilai dalam
hal kekuatan tarikan dynecm yang dibutuhkan untuk melepaskan kontak antara sediaan film alginat-kitosan dengan jaringan mukosa. Pada alat ini diatur bagian wadah
tempat sampel sebagai tempat plat film, dan pada ujung kawat pengait di tempatkan jaringan mukosa lambung yang ditempelkan pada pelat.
Uji dilakukan menggunakan jaringan mukosa lambung tikus. Tikus dikorbankan dengan cara dislokasi leher. Jaringan mukosa lambung dibuka sepanjang
kurvatura mayor, dicuci dengan NaCl fisiologis dan diequilibrasi pada 37 ± 0,5
o
C dalam asam lambung buatan pH 1,2 selama 10 menit sebelum uji bioadhesif. Jaringan
mukosa lambung dipotong kira-kira 1 x 1 cm dan ditempelkan pada pelat akrilat, pelat akrilat dikaitkan dengan kawat penarik tensiometer dengan mukosa lambung
menghadap ke bagian bawah. Pada sisi tempat sampel dipasang film alginat-kitosan ukuran 2 x 5 cm yang telah dikondisikan dalam medium lambung buatan pH 1,2 selama
10 menit sebelumnya. Kemudian keduanya diposisikan secara bersentuhan dengan tekanan konstan selama 5 menit. Setelah 5 menit, pengait ditarik ke atas dengan
memutar penarik tensiometer sampai kontak antara film dan jaringan terlepas. Gaya
Universitas Sumatera Utara
dynecm
2
yang dibutuhkan untuk melepaskan antara film dan jaringan diamati pada skala tensiometer dan dicatat. Pengujian ini dilakukan tiga kali ulangan.
3.13 Scanning Electron Microscopy SEM