Optimasi clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18

Gambar 8. Kromatogram dengan fase diam C18, fase gerak asetonitril:air 10:90, laju alir = 0,5 mLmenit, volume inject 20 µL A ekstrak sampel sebelum dilakukan clean-up dengan SPE C18, B Ekstrak sampel sesudah dilakukan clean-up dengan SPE C18 Gambar 8 menunjukkan bahwa clean-up dengan SPE C18 dapat memisahkan PPD dari matriks sampel yang mengganggu dalam determinasinya. Pada Gambar 8B dapat dilihat puncak PPD muncul pada t R 4,8 menit dan terpisah dari puncak lainnya dengan resolusi ≥ 1,5. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan sudah memenuhi parameter spesifisitas.

E. Optimasi clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18

Ekstraksi merupakan proses untuk mengambil analit yang dituju dari matriks sampelnya. Ekstraksi yang dilakukan menggunakan pelarut air yang diberi antioksidan sodium metabisulfit pada pH 8. Sodium metabisulfit dipilih A B sebagai antioksidan karena merupakan antioksidan yang kuat dan stabil sehingga dapat mencegah oksidasi PPD. PPD merupakan senyawa yang bersifat basa lemah dengan pKa 6,42 dan 3,04. Menurut Corbett 1972, laju auto-oksidasi PPD minimal terjadi saat pH 8, oleh karena itu digunakan pelarut dengan pH 8 untuk meminimalkan auto-oksidasi pada PPD dan sekaligus untuk membuat PPD dalam bentuk molekulnya. Endapan dan cairan solven dipisahkan dengan teknik sentrifugasi. Metode sentrifugasi dapat memisahkan PPD yang terekstrak dengan matriks sampel dengan proses yang memanfaatkan gaya sentrifugal untuk sedimentasi campuran. Komponen yang mempunyai massa jenis lebih besar akan mengendap, menyisakan cairan supernatan yang mudah diambil. PPD akan berada dalam larutan supernatan karena PPD larut dalam air. Clean-up merupakan praperlakukan sampel yang bertujuan untuk memisahkan analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin menganggu pada saat pengukuran atau deteksi analit. Pada penelitian ini clean-up dilakukan dengan metode solid phase extraction SPE karena praktis dan hemat pelarut Watson, 1999. Strategi yang digunakan dalam clean-up dengan SPE ada 2 macam yaitu dengan memilih pelarut yang mampu mengelusi analit sehingga analit tertahan pada penjerap dan komponen pengganggu terelusi atau dengan memilih pelarut yang langsung dapat mengelusi analit sementara komponen pengganggu tertahan dalam penjerap. Pemilihan jenis SPE yang digunakan berdasarkan skema yang terdapat dalam Gambar 9. Pada penelitian ini, matriks sampel bersifat aqueous karena digunakan air sebagai pelarut sampel. PPD bersifat polar dengan log Kow -0,25 sehingga PPD mudah larut dalam air. PPD bersifat basa lemah sehingga pH perlu dijaga dengan cara membuat pH pelarut menjadi pH 8 untuk menjaga PPD tetap dalam bentuk molekulnya netral. Oleh karena itu, PPD akan sulit tertahan dalam penjerap sehingga diperlukan penjerap yang mampu menahan komponen pengotornya. Gambar 9. Skema untuk pemilihan jenis SPE Sigma-Aldrich, 1998. Komponen-komponen yang kemungkinan terjerap adalah senyawa- senyawa dalam ekstrak henna, ekstrak Acacia concina dan ekstrak Emblica officinalis . Sodium perborat tetrahidrat dan asam sitrat akan langsung terelusi. Berdasarkan skema tersebut, maka SPE yang digunakan dalam penelitian ini yaitu SPE C18. Strategi dalam SPE yang digunakan yaitu dengan menahan komponen pengotor pada penjerap sementara PPD langsung terelusi. SPE yang digunakan bersifat sangat nonpolar karena sudah di-endcapped dengan C18. Oleh karena itu, PPD akan langsung terelusi sementara komponen pengotor akan tertahan dalam penjerap. Menurut Watson 1999, pengkondisian SPE perlu dilakukan dengan menggunakan pelarut sampel dengan volume 5-10 kali volume fase diam. Pengkondisian bertujuan untuk membasahi permukaan fase diam dan untuk menciptakan nilai pH yang sesuai sehingga perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan dapat dihindari. Setelah dilakukan pengkondisian, ekstrak sampel dimasukkan dalam SPE loading. Untuk memperoleh hasil yang optimal maka dilakukan optimasi volume loading ekstrak sampel. Pada penelitian ini, optimasi volume loading ekstrak sampel dilakukan untuk melihat kapasitas SPE dalam mengikat pengotor pada sampel. Kemampuan penjerap dalam menahan pengotor yang ada di dalam sampel dapat diketahui dengan memvariasi banyaknya pengotor dengan cara merubah volume larutan sampel yang dimasukkan dalam SPE. Variasi volume loading ekstrak sampel yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 100 µL dan 1 mL. Eluat hasil SPE kemudian ditampung dalam tabung mikrosentrifus dan disaring dengan milipore dan diinjeksikan dalam KCKT. Hasil optimasi volume loading ekstrak sampel ditunjukkan oleh Gambar 10. Gambar 10. Kromatogram dengan fase diam C18, fase gerak asetonitril:air 10:90, laju alir = 0,5 mLmenit, volume inject 20 µL A Volume loading sampel 100 µL, B Volume loading sampel 1 mL, C Baku PPD 8 gmL Gambar 10 menunjukkan bahwa puncak PPD muncul pada t R sekitar 4,8 menit dan puncak sodium metabisulfit muncul pada t R sekitar 1,9 menit. Jika A B C dilihat dari kromatogram di atas dapat disimpulkan bahwa volume loading sampel 100 µL lebih baik dibandingkan volume loading sampel 1 mL karena pada volume loading sampel 100 µL puncak yang dihasilkan lebih sedikit daripada volume loading sampel 1 mL. Jumlah puncak lebih sedikit berarti jumlah pengotor lebih sedikit yang disebabkan karena pengotor dapat tertahan pada penjerap kapasitas SPE belum terlampaui. Kromatogram volume loading sampel 1 mL menghasilkan puncak yang banyak. Jumlah puncak banyak berarti banyak pengotor yang ikut terelusi karena kapasitas SPE sudah terlampaui.

F. Validasi metode clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18