3.8 Alur Kerja
Gambar 10. Alur Kerja
3.9 Data yang Dikumpulkan
Kuesioner dan data klinis dikumpulkan oleh dokter terlatih untuk mengisi data demografiklinis subjek. Rekam medis subjek SNRS dan
SNSS dikumpulkan dan ditelaah secara retrospektif untuk mendapatkan data klinis dan laboratoris pada saat diagnosis dan tindak lanjut. Data
yang dikumpulkan melalui rekam medis meliputi: identitas subjek nama, umur, jenis kelamin, suku, alamat, anamnesis gejala pada awal masuk,
ureum dan kreatinin darah, pengobatan yang diterima, dan luaran. Data pada saat penelitian meliputi pemeriksaan fisis umur saat penelitian,
Subjek terpilih
PCR-RFLP Variabel kategorikal
Analisis statistik ELISA MIF
Variabel numerik EIA Angiotensin II
Variabel numerik
Hasil Informed consent
Anamnesis, pemeriksaan fisis, dan urinalisis
Universitas Sumatera Utara
berat badan, tinggi badan, tekanan darah, proteinuria kuantitatif UACR, genotip polimorfisme -173 G ke C gen MIF, kadar angiotensin II plasma,
dan MIF serum.
3.10 Pemeriksaan 3.10.1 Pemeriksaan Antropometris
Pengukuran berat badan menggunakan timbangan berat badan digital merek AND dengan kapasitas 150 kg dan ketelitian 50 gram. Pada
waktu ditimbang anak hanya menggunakan baju yang tipis dan tidak menggunakan sepatu. Tinggi badan diukur dengan Statumeter. Pada
waktu diukur anak berdiri dengan kedua tumit bertemu dan bagian belakang kepala menyentuh dinding pengukur dengan batas ketelitian
pengukuran 0,1 cm dan batas pengukuran terpanjang 200 cm. Untuk anak yang belum bisa berdiri, pengukuran berat badan dengan menggunakan
timbangan bayi sedangkan pengukuran panjang badan dengan microtoise. Evaluasi ukuran antropometri tersebut menggunakan
rekomendasi NCHS CDC 2000. Z score standar deviasi digunakan sebagai ambang batas.
3.10.2
Pengukuran tekanan darah dilakukan dalam suasana tenang. Anak berusia tiga tahun atau lebih diposisikan berbaring atau duduk tenang
lebih kurang lima menit sebelum prosedur pemeriksaan. Manset dipasang pada lengan atas kanan, sehingga panjang manset melingkupi minimal
80 lingkar lengan atas dan lebar manset lebih dari 40 lingkar lengan
Pemeriksaan Fisis Tekanan Darah
Universitas Sumatera Utara
atas. Pengukuran dilakukan sebanyak tiga kali berjarak 30 menit dengan sphygmomanometer air raksa merek Riester buatan Jerman dengan
ketelitian 2 mmHg. Hasil pengukuran adalah rerata ketiga pengukuran tersebut. Cara pengukuran: manset dibalutkan kuat pada lengan atas
dengan batas bawah lebih kurang 3 cm dari fosa kubiti dan dipompa kira- kira 20-30 mmHg di atas tekanan yang diperlukan untuk menimbulkan
sumbatan pada arteri brakhialis. Tekanan dalam manset kemudian diturunkan perlahan-lahan dengan kecepatan 2-3 mmHgdetik sampai
terdengar bunyi suara lembut. Bunyi ini merupakan fase-1 Korotkof dan merupakan petanda tekanan darah sistolik. Fase-1 ini kemudian disusul
fase-2 yang ditandai dengan suara bising murmur, dan disusul pula dengan fase-3 berupa suara yang keras. Setelah itu, suara mulai menjadi
lemah fase-4 dan akhirnya menghilang fase-5. Fase-5 merupakan petanda tekanan darah diastolik, tetapi pada beberapa anak, jika fase-5
sulit didengar, fase-4 digunakan sebagai petunjuk tekanan darah diastolik NHBPEP., 2004. Batasan tekanan darah normal adalah tekanan darah
sistolik dan diastolik kurang dari 90 persentil menurut jenis kelamin, usia, dan tinggi badan Lampiran 1 dan 2.
3.10.3 Pemeriksaan Proteinuria Kuantitatif
Pengukuran proteinuria kuantitatif sebagai indeks perjalanan klinis penyakit ginjal Hogg et al., 2000 dipakai metode rasio albumin kreatinin
urin sewaktu UACR. Sampel urin diambil oleh subjek atau dibantu orang tua subjek pada urin pertama atau kedua pada pagi hari dan dikumpulkan
di laboratorium bersertifikasi. Albumin urin diukur dengan nephelometri.
Universitas Sumatera Utara
Koefisien variasi interpemeriksaan adalah 4,4 dan intrapemeriksaan adalah 4,3. Konsentrasi kreatinin urin diukur dengan metode standar
Jaffe koefisien variasi inter dan intrapemeriksaan 3,3 .
3.10.4
Pengambilan sampel darah untuk isolasi DNA dilakukan di laboratorium sebanyak 1 ml dan disesuaikan dengan waktu pemeriksaan
darah lainnya pukul 08.00-10.00 pagi. Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan kit buatan Amerika Promega. Sampel darah
diproses oleh penelitiasisten sampai tahap pembentukan isolat DNA, PCR, pelaksanaan restriksi, dan elektroforesis di Laboratorium terpadu FK
USU. Empat puluh isolat dikirim ke Laboratorium Biokimia Universitas Gadjah Mada Jogjakarta untuk proses optimasi suhu.
Analisis Genotip Polimorfisme -173 G ke C Gen MIF
Pemeriksaan genotif polimorfisme -173 G ke C gen MIF telah diterangkan oleh Donn et al. Donn et al., 2002. Polymerase Chain
Reaction dengan metode Restriction Fragment Length Polymorphism PCR-RFLP digunakan untuk mengamplifikasi fragment 366 bp. Metode
ini dipilih karena mudah dan sederhana dalam menentukan lokasi kromosom spesifik Read dan Donnai, 2007. Forward primer adalah 5’-
ACT- AAG-AAA-GAC-CCGAGGC-3’ dan reverse primer adalah 5’-GGG- GCA-CGT-TGG-TGT-TTA-C-3’.Untuk pencernaan produk PCR digunakan
enzim restriksi Alu I, pada suhu 37 ° C semalaman. Hasil PCR DNA dianalisis pada gel agarose 2,5 dengan pewarnaan 10 etidium
bromide sehingga dapat divisualisasi dengan kamera ultraviolet. Genotip GG ditandai dengan 2 pita, yaitu pada 98 bp dan 268 bp. Genotip CC
Universitas Sumatera Utara
ditandai dengan 3 pita, yaitu pada 205 bp, 98 bp, dan 63 bp. Genotip GC ditandai dengan 4 pita, yaitu pada 268 bp, 205 bp, 98 bp dan 63 bp
Lampiran 7. Validitas pemeriksaan dilakukan dengan duplikasi sampel.
3.10.5 Analisis Angiotensin II Plasma
Subjek berpuasa pada malam hari sebelum pengambilan darah pada hari berikutnya. Kelompok SNRS dan SNSS dalam fase remisi
dilakukan pengambilan sampel darah setelah minimal dua minggu selesai dari dosis penuh prednison. Pengambilan sampel darah dilakukan pada
pagi hari 08.00-10.00 sebanyak 2 ml dan dianalisis di laboratorium bersertifikasi. Angiotensin II plasma diukur dengan metode ELISA
Calbreath,1992 dengan menggunakan kit merk Enzo katalog ADI-900- 204 lot 10191101. Sensitivitas pemeriksaan adalah 1 pgmL. Koefisien
variasi inter dan intrapemeriksaan adalah 7. Reaksi imunologis antara angiotensin II dan antiangiotensin II diikat
secara kovalen dengan glutaraldehid. Setelah pencucian dan denaturasi, angiotensin II bereaksi kembali dengan acetylcholinesterase antibodi yang
digunakan sebagai tracer. Selanjutnya, sumuran dicuci kembali dan ditambahkan kromogen yang dapat menyebabkan perubahan warna.
Intensitas warna diukur dengan spektrofotometri dan hal ini proporsional dengan kadar angiotensin II Lampiran 8. Validitas pengukuran
dilakukan dengan duplikasi sampel dan pengulangan kadar angiotensin II dilakukan pada saat pengukuran yang berbeda.
Universitas Sumatera Utara
3.10.6 Analisis MIF serum
Pengambilan sampel darah sebanyak 2 ml dilakukan pada pukul 8- 10 pagi di laboratorium bersertifikasi. Pada kelompok SNRS dan SNSS
dalam fase remisi dilakukan pengambilan sampel darah setelah minimal 2 minggu selesai dari dosis penuh prednison. Sampel darah kemudian
disimpan pada suhu -20°C. Pengukuran kadar MIF serum dilakukan dengan metode sandwich ELISA Calbreath,1992 menggunakan
Quantikine buatan RD Systems Amerika Serikat katalog DMF008 lot 294789. Batas kemampuan mendeteksi MIF serum dengan menggunakan
ELISA adalah 1-2 ngmL. Koefisien variasi intrapemeriksaan adalah di bawah 5. Koefisien variasi interpemeriksaan adalah di bawah 7.
Antibodi monoklonal spesifik untuk MIF dilapisi ke mikroplate. Standar dan sampel dipipet ke dalam sumuran dan setiap keberadaan
MIF diikat dengan antibodi. Setelah dilakukan pencucian terhadap substansi yang tak terikat, ditambahkan antibodi poliklonal spesifik untuk
MIF. Setelah pencucian reagen antibodi dan enzim yang tak terikat, ditambahkan larutan substrat ke dalam sumuran dan timbul warna yang
proporsional dengan jumlah MIF yang terikat. Intensitas warna kemudian diukur Lampiran 9. Validitas pengukuran dilakukan dengan duplikasi
sampel dan pengulangan kadar MIF dilakukan pada saat pengukuran yang berbeda
.
3.11 Identifikasi Variabel
Variabel bebas adalah SN resisten steroid, SN sensitif steroid, dan anak sehat. Variabel tergantung adalah genotip MIF skala kategorikal, kadar
Universitas Sumatera Utara
angiotensin II plasma skala numerik, kadar MIF serum skala numerik, dan tekanan darah skala numerik.
3.12 Definisi Operasional
a Pasien SNRS ialah keadaan pasien SN tetap mengalami proteinuria
masif di atas atau sama dengan +2 secara semikuantitatif pada 3 kali pemeriksaan berturut dalam 1 minggu setelah 4 minggu dosis
penuh prednison 2 mgkghari. b
Pasien SNSS adalah suatu keadaan pasien SN yang mengalami remisi proteinuria lebih kecil dari 4 mgm
2
c Anak sehat didefinisikan sebagai seseorang yang belum berusia 18
tahun UU No.23 tahun 2002 tentang perlindungan anak; UU No.36 tahun 2009 tentang kesehatan dan dikonfirmasi dengan fungsi ginjal
normal kisaran eGFR normal sesuai umur, jenis kelamin dan ukuran tubuh serta rasio albumin kreatinin urin kurang 150 µgmg kreatinin.
LPTjam dengan pemberian prednison pada 3 kali pemeriksaan berturut-turut dalam 1
minggu. Berdasarkan frekuensi dan waktu terjadinya relaps pasien SNSS diklasifikasikan atas relaps jarang, relaps sering dan dependen
steroid. Karena itu, dalam penelitian ini diambil sebagai panduan, yaitu SN remisi rasio albumin kreatinin urin di bawah 2 mgmg
d Alel C sebagai faktor risiko SNRS adalah apabila mempunyai genotip
GC atau CC -173 gen MIF. Genotip MIF merupakan variabel kategorikal dan dikelompokkan atas GG alel G,GC dan CC alel C.
Universitas Sumatera Utara
Pengelompokan atas alel ini penting oleh karena analisis data yang akan dipresentasikan, lebih bersifat hubungan yang multiplikatif.
e Angiotensin II plasma: angiotensin II yang diukur kadar pada plasma.
Angiotensin II plasma merupakan variabel numerik. Nilai cut off diambil dari perpotongan sensitivitas dan spesifisitas dan nilai tinggi
bila di atas 18,2 pgmL. f
MIF serum ialah kadar MIF yang diukur pada serum. MIF serum merupakan variabel numerik. Nilai cut off diambil dari perpotongan
sensitivitas dan spesifisitas dan nilai tinggi bila di atas 27,9 ngmL g
Tekanan darah: diukur dengan menggunakan sphygmomanometer air raksa merek Riester buatan Jerman dengan ketelitian 2 mmHg.
Tekanan darah diukur dengan variabel numerik dan dikelompokkan atas dua kelompok, yaitu hipertensi dan normotensi. Hipertensi ialah
rata-rata tekanan darah sistolik TDS dan atau diastolik TDD lebih dari atau sama dengan persentil ke 95 untuk usia, jenis kelamin dan
tinggi badan. Normotensi ialah rata-rata TDS dan atau TDD kurang dari persentil 95.
h Proteinuria adalah ditemukan protein dalam urin secara kuantitatif
berdasarkan rasio albumin kreatinin. Rasio albumin kreatinin urin yang lebih besar dari 2000 µgmg kreatinin disebut sebagai
proteinuria nefrotik. Remisi adalah apabila lebih kecil dari 2000 µgmg kreatinin dan pada anak sehat adalah apabila lebih kecil dari
150 µgmg kreatinin.
Universitas Sumatera Utara
3.13 Pengolahan dan Analisis Data
Kategori