Uji tahap pertama orientasi dosis Uji tahap ke dua uji pendahuluan Uji tahap ke tiga uji sebenarnya

5452 menentukan besarnya dosis yang menyebabkan kematian 50 pada hewan uji setelah pemberian dosis tunggal. DL 50 bahan obat mutlak harus ditentukan karena nilai ini digunakan dalam penilaian rasio manfaat khasiat dan daya racun yang dinyatakan sebagai indeks terapi obat DL 50 DE 50 . Makin besar indeks terapi, makin aman obat tersebut jika digunakan. Ada berbagai metode perhitungan DL 50 yang umum digunakan antara lain metode Miller-Tainter, metode Reed-Muench, metode Kärber dan metode Thomson-Weil. Dalam Penelitian ini dipilih metode Thomson-weil karena dianggap paling sederhana. Penelitian ini bertujuan untuk menguji toksisitas akut secara oral tumbuhan obat yang banyak digunakan oleh masyarakat dan belum memiliki data DL 50 , juga mendapatkan hasil perhitungan DL 50 dengan metode Thomson-Weil. Bahan yang diuji yaitu kulit batang malaka Phyllantus emblica L. yang secara empiris berkhasiat sebagai antidiabetes.

II. Bahan Dan Metode

Sampel yang diteliti adalah kulit batang malaka P hylanthus emblica L., yang masih segar, diambil dari Pasar 7 Kecamatan Medan Tembung, Medan, Sumtera Utara. dan dideterminasi di LIPI Jakarta. Setelah dicuci, bahan dikeringkan dan dijadikan serbuk kemudian dibuat ekstrak kering Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara perkolasi menggunakan pelarut etanol 96. Selanjutnya dilakukan skrining dan uji karakterisasi simplisia. Hewan uji adalah mencit jantan dengan bobot badan 20-30 g, diperoleh dari Fakultas Farmasi USU medan. Uji toksisitas dilakukan dengan tahapan kerja penetapan dosis pada 3 tahap yaitu tahap pertama orientasi dosis, uji tahap kedua uji pendahuluan dan uji tahap ketiga uji sebenarnya. Bahan uji diberikan secara oral terhadap mencit yang dibagi menjadi 5 kelompok dosis, 4 kelompok uji dan 1 kelompok kontrol. Tiap kolompok terdiri dari 5 ekor mencit, ekstrak etanol kulit batang malaka diberikan dengan dosis sesuai dengan tahapan uji, sedangkan kelompok kontrol hanya diberi lautan CMC 0,5. Semua diberikan dengan volume 1 ml per 20 g bobot badan. Sebelum diberikan bahan uji, mencit diamati perilakunya. Setelah pemberian, efek diamati selama 24 jam. Data kematian hewan uji diolah untuk menentukan nilai DL 50 yang dihitung menggunakan metode Thomson-Weil. Selanjutnya mencit yang mati segera dibedah untuk mengamati kerusakan organ hati dan ginjalnya yang terlebih dahulu dibuat preparat organ hati dan ginjalnya. Agar dapat bertahan lama preparat ditambahkan dengan larutan formalin 10. Pengujian toksisitas Uji toksisitas dilakukan dengan tahapan kerja penetapan dosis dilakukan pada 3 tahap yaitu tahap pertama orientasi dosis, uji tahap kedua uji pendahuluan dan uji tahap ketiga uji sebenarnya

a. Uji tahap pertama orientasi dosis

Untuk menentukan dosis uji toksisitas, terlebih dahulu dilakukan orientasi yaitu dengan memilih dosis secara acak dengan 4 peringkat dosis menggunakan 12 ekor mencit jantan dibagi menjadi 4 kelompok yang masing-masing terdiri dari 3 ekor mencit jantan. 4 kelompok tersebut yaitu : a Kelompok Perlakuan I P1, diberikan larutan uji dosis I b kelompok Perlakuan II P2, diberikan larutan uji dosis II c kelompok Perlakuan III P3, diiberikan larutan uji dosis III d kelompok Perlakuan IV P4, diberikan larutan uji dosis IV Bila pada pengujian orientasi terdapat kematian hewan uji pada salah satu kelompok selama pengamatan 24 jam, percobaan dilanjutkan ke uji tahap ke dua.

b. Uji tahap ke dua uji pendahuluan

Bila dalam orientasi terjadi kematian pada salah satu kelompok maka dilanjutkan ke uji tahap pendahuluan. Jumlah hewan yang digunakan 20 ekor mencit, terbagi menjadi 4 kelompok yang masing- 5453 masing terdiri dari 5 ekor mencit. Dosis terkecil dalam kelompok mendekati dosis saat terjadi kematian dalam orientasi. 4 kelompok tersebut yaitu : a Kelompok Perlakuan I P1, diberikan larutan uji dosis I b kelompok Perlakuan II P2, diberikan larutan uji dosis II c kelompok Perlakuan III P3, diberikan larutan uji dosis III d kelompok Perlakuan IV P4, diberikan larutan uji dosis IV Bila dalam uji pendahuluan terjadi kematian pada salah satu kelompok minimal 2 ekor, selama pengamatan 24 jam, maka percobaan dilanjutkan ke uji sebenarnya.

c. Uji tahap ke tiga uji sebenarnya

Bila pada salah satu kelompok dalam percobaan tahap ke dua tidak terdapat kematian, dan pada kelompok lain di atasnya terdapat kematian seluruh hewan percobaan dalam waktu 24 jam, disiapkan 30 ekor mencit jantan yang terbagi menjadi 6 kelompok, yang masing-masing terdiri atas 5 ekor mencit. Untuk penetapan dosis uji sebenarnya digunakan suatu kelipatan dosis R yang dapat dihitung dengan cara sebagai berikut: R = antilog d d = Selanjutnya, kelipatan dosis yang baru adalah R sehingga dosis tiap kelompok meningkat secara kelipatan R. Adapun 6 kelompok tersebut yaitu : a Kelompok Kontrol K : diberikan larutan suspensi CMC b Kelompok Perlakuan I P1 : diberikan larutan uji dosis I c Kelompok Perlakuan II P2 : diberikan larutan uji dosis II d Kelompok Perlakuan III P3 : diberikan larutan uji dosis III e Kelompok Perlakuan IV P4 : diberikan larutan uji dosis IV f Kelompok Perlakuan V P5 : diberikan larutan uji dosis V Pengamatan dilakukan selama 24 jam setelah pemberian sediaan uji dengan dosis sesuai perhitungan kelipatan dosis. Pengamatan dilakukan intensif pada 24 jam pertama setelah perlakuan, yaitu pengamatan gejala toksik, penentuan, kemudian dilanjutkan sampai 14 hari. Jumlah kematian yang terdapat pada masing-masing kelompok kemudian disesuaikan dengan tabel perhitungan LD 50 yang telah disusun oleh Weil dan dilakukan perhitungan LD 50 Harmita, Maksum, 2008. dan dilakukan pemeriksaan histopatologi organ. Pemeriksaan histopatologi Pengamatan dilakukan selama 14 hari, dilakukan secara intensif dimulai pada 24 jam pertama setelah pemberian suspensi sediaan uji, bila ada hewan uji yang mati sebelum jam ke-24 setelah pemberian suspensi sediaan uji, sesegera mungkin dibedah pada bagian perut. Proses pengambilan organ dengan cara pembedahan yaitu hewan uji dibaringkan terlentang dan seluruh permukaan ventral disiram dengan alkohol 70 untuk mengurangi kemungkinan pencemaran ke ruangan atau kontaminasi selama pembedahan. Kulit pada bagian medial abdomen dijepit menggunakan pinset, lalu dibuat irisan kecil pada kulit menggunakan gunting pada medial abdomen. Kulit dirobek dengan gunting ke arah kepala sehingga kulit terkelupas, dan tampak peritoneum. Peritoneum dirobek hingga terlihat dinding kosta, lalu tulang sternum dipotong. Lalu diambil organ hati dan ginjal, dan dibersihkan dari jaringan ikat maupun pembuluh darah yang tersisa dengan cara dicuci dengan akuades, selanjutnya dimasukkan ke dalam pot berisi cairan pengawet buffer formalin 10, untuk selanjutnya dilakukan pembuatan preparat untuk melihat gambaran histopatologis. 5454 Pembuatan Preparat Pembuatan preparat dilakukan oleh teknisi laboratorium Patologi Anatomi, di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU. Dengan cara sebagai berikut : organ hati difiksasi dengan larutan formalin kemudian masuk dalam alcohol 70. Setelah itu, dipotong-potong dan dimasukkan dalam tissue cassette untuk melewati proses dehidrasi dalam seri alkohol bertingkat yaitu mulai dari alkohol 80 sampai alkohol absolute. Penjernihan jaringan hati dilakukan dengan xylol lalu di embedding dalam farafin. Blok jaringan diotong menggunakan mikrotom 5µm dan potongan jaringan dilekatkan pada gelas objek. Pewarnaan Hematoxylin Eosin HE Pewarnaan Hematoxylin Eosin dilakukan untuk mengamati struktur umum jaringan. Tahapan yang dilakukan dalam pewarnaan ini dimulai dengan deparafinisasi, yaitu penghilangan paraffin dengan memasukkan preparat ke dalam sari larutan xylol. Tahap selanjutnya adalah rehidrasi, yaitu dengan memasukkan preparat ke dalam seri larutan alkohol absolute sampai alcohol 70. Preparat direndam dalam air kran, kemudian dalam aquadest. Preparat diwarnai dengan hematoxylin dilanjutkan lagi dengan perendaman dalam aquadest. Setelah itu, preparat diwarnai menggunakan eosin alkohol diikuti perendaman kembali dengan aquadest. Kemudian dilakukan proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat serta penjernihan clearing dengan menggunakann xylol. Sediaan di tutup dengan cover glass mounting

III. Hasil Dan Pembahasan

1. Pemeriksaan karakterisasi kulit batang malaka dapat dilihat pada tabel1 sebagai berikut : Tabel 1. Hasil Karakterisasi Kulit Batang Malaka No Parameter Hasil 1 2 3 4 5 Penetapan kadar air Penetapan kadar abu Penetapan kadar sari larut dalam etanol Penetapan kadar sari larut dalam air Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam 5,62 8,45 26,1 17,3 0,45 2. Hasil skrining fitokimia dapat dilihat pada Tabel 2.