14
untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak ke bawah kolom.Pada waktu yang hampir bersamaan, Day juga menggunakan kromatografi
untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett adalah yang pertama diakui sebagai penemu yang pertama kali mengenali dan menafsirkan proses
kromatografi Johnson dan Stevenson, 1978.
2.6.2 Pembagian Kromatografi
Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam, tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pmisahannya, kromatografi
dibedakan menjadi: a kromatografi adsorbsi; b kromatografi partisi; c kromatografi pasangan ion; d kromatografi penukar ion e kromatografi
eksklusi ukuran dan f kromatografi afinitas Johnson dan Stevenson, 1978; Rohman, 2007.
Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: a kromatografi kertas; b kromatografi lapis tipis, yang kedua sering disebut
kromatografi planar; c kromatografi cair kinerja tinggi KCKT dan d kromatografi gas KG Johnson dan Stevenson, 1978; Rohman, 2007.
2.6.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT merupakan teknik pemisahan yang didukung oleh kemajuan teknologi yang canggih untuk menganalisis
berbagai analit secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran, senyawa bahan aktif obat, menganalisis kemurnian suatu
senyawa didalam suatu cuplikan Ditjen POM, 1995. Kegunaan umum dari KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa
organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian
15
impurities dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap nonvolatile. KCKT sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa
tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain
Rohman, 2007.
2.6.4 Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya KCKT dapat dikelompokkan menjadi KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik.Untuk fase normal fase
gerak lebih polar daripada fase gerak, sementara untuk fase terbalik fase diam kurang polar daripada fase gerak.Fase terbalik menggunakan fase diam silika
yang dimodifikasi secara kimiawi seperti oktadesilsilan ODS atau C
18
dan fase gerak campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan buffer.
Untuk solut yang bersifat asam lemah,peranan pH sangat krusial karena bila pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonisasi.
Terbentuknya bagian yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk yang tidak
terionisasi akan terelusi lebih cepat Rohman, 2007. 2.6.5 Proses Pemisahan dalam Kolom Kromatografi Cair
Pemisahan analit dalam kolom kromatografi berdasarkan pada aliran fase gerak yang membawa campuran analit melalui fase diam dan perbedaan interaksi
analit dengan permukaan fase diam sehingga terjadi perbedaan waktu perpindahan
setiap komponen dalam campuran Meyer, 2010.
Sebagai contoh, campuran dua komponen dimasukkan ke dalam sistem kromatografi partikel
● dan ▲.Di mana komponen ▲ cenderung menetap di
16
fase diam dan komponen ● lebih cenderung di dalam fase gerak. Ilustrasi proses
pemisahan dalam kolom kromatografi dapat dilihat pada Gambar 3 berikut.
Gambar3 . Ilustrasi proses pemisahan yang terjasi di dalam kolom KCKT
Sumber: Meyer, 2010.
Masuknya eluen fase gerak yang baru ke dalam kolom akan menimbulkan kesetimbangan baru, molekul sampel dalam fase gerak diadsorpsi
sebagian oleh permukaan fase diam berdasarkan pada koefisien distribusinya, sedangkan molekul yang sebelumnya diadsorpsi akan muncul kembali di fase
gerak Gambar 4c. Setelah proses ini terjadi berulang kali, kedua komponen akan terpisah. Komponen
● yang lebih suka dengan fase gerak akan berpindah lebih cepat daripada komponen
▲ yang cenderung menetap di fase diam, sehingga komponen
● akan muncul terlebih dahulu dalam kromatogram, kemudian diikuti oleh komponen
▲ Meyer, 2010.
2.7 Parameter Penting dalam Kromatografi Cair 2.7.1 Waktu tambat
