24 mendidih 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian
kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik, setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan
selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan
ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen
WHO, 1998.
3.5.5 Penetapan kadar sari larut air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu
bersumbat, dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam
cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105ºC sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang
larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.5.6 Penetapan kadar sari larut etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 di dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam
pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 ºC sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam
etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
25
3.5.7 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600 ºC selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh
bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes
RI, 1995. 3.5.8 Penetapan kadar abu tidak larut asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas, lalu dipijar sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu
yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995. Perhitungan pemeriksaan karakteristik serbuk simplisia daun
sisik naga dapat dilihat pada Lampiran 8, halaman 56- 58 .
3.6 Skrining Fitokimia
3.6.1 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit,
didinginkan dan disaring, filtrat dipakai untuk uji alkaloida. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan 0,5 ml filtrat.
Pada tabung I : ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan
menggumpal berwarna putih atau kuning.
26 Pada tabung II
: ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan berwarna coklat atau jingga kecoklatan.
Pada tabung III : ditambahkan 2 tetes pereaksi Bourchardat, akan terbentuk
endapan berwarna coklat sampai kehitaman. Alkaloid disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua atau
tiga dari percobaan di atas Depkes RI, 1995.
3.6.2 Pemeriksaan flavonoida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 10 g, ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml
filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi
warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.6.3 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran dari 7 bagian etanol 96 dengan 3 bagian air suling 7:3 dan 10 ml
asam klorida 2 N. Direfluks selama 10 menit, didinginkan, lalu disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M
dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, perlakuan ini diulangi sebanyak 3 kali. Sari
organik dikumpulkan dan ditambahkan Na
2
SO
4
anhidrat, disaring, kemudian diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50ºC, sisanya dilarutkan dalam 2 ml
metanol. Sari air digunakan untuk percobaan berikut, 0,1 larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian diuapkan di atas penangas air. Pada
27 sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes larutan pereaksi Molish, lalu ditambahkan
dengan perlahan-lahan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula glikon
atau glikosida Depkes RI, 1995.
3.6.4 Pemeriksaan saponin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok
kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuknya busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam
klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1995.
3.6.5 Pemeriksaan tanin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan
diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth,
1966.
3.6.6 Pemeriksaan steroida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan
penguap, pada sisa ditambahkan beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard. Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida, sedangkan
warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoida Harborne, 1987.
28
3.7 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak daun sisik naga dilakukan dengan cara maserasi bertahap.
Prosedur pembuatan ekstrak: sebanyak 200 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam wadah kaca, dituangi dengan 1500 ml n-heksan, ditutup, dibiarkan
selama 5 hari terlindung dari cahaya dan sesekali diaduk. Setelah 5 hari campuran tersebut diserkai saring. Ampas dicuci dengan n-heksan secukupnya hingga
diperoleh 2000 ml, lalu dipindahkan dalam bejana tertutup dan dibiarkan di tempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari, kemudian dienaptuangkan lalu
disaring. Maserat dipekatkan menggunakan alat rotary evaporator pada suhu 40°C kemudian dikeringkan menggunakan freeze dryer. Ampas dikeringkan lalu
diekstraksi dengan menggunakan pelarut berturut-turut etilasetat dan etanol dengan prosedur yang samadi atas Depkes, 1979.
3.8 Pengujian Aktivitas Antioksidan
3.8.1 Prinsip metode pemerangkapan radikal bebas DPPH
Kemampuan sampel uji dalam meredam proses oksidasi radikal bebas DPPH 1,1 diphenyl-2-picryl-hidrazyl dalam larutan metanol ditandai dengan
perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning dengan nilai IC
50
konsentrasi sampel uji yang mampu meredam radikal bebas 50 digunakan sebagai
parameter menentukan aktivitas antioksidan sampel uji Molyneux, 2004.
29
3.8.2 Pembuatan larutan Larutan DPPH
Sebanyak 10 mg DPPH ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dicukupkan volumenya dengan metanol sampai garis tanda,
diperoleh larutan DPPH 0,5 mM konsentrasi 200 ppm.
Larutan DPPH 0,5 mM dipipet sebanyak 5 ml, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, dicukupkan volumenya dengan metanol sampai garis
tanda, diperoleh larutan blanko DPPH konsentrasi 40 ppm. Larutan sampel uji
Masing-masing sebanyak 25 mg ekstrak n-heksan, ekstrak etilasetat dan ekstrak etanol daun sisik naga ditimbang, dimasukkan ke dalam labu 25 ml
dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan sampai garis tanda, diperoleh larutan induk baku sampel konsentrasi 1000 ppm.
Masing-masing larutan induk dipipet sebanyak 2,5 ml; 5 ml; 10 ml; 20 ml ke dalam masing-masing labu tentukur 25 ml untuk mendapatkan konsentrasi
larutan uji 100 ppm, 200 ppm, 400ppm, 800ppm kemudian ditambahkan 5 ml larutan DPPH 0,5 mM konsentrasi 200 ppm lalu volumenya dicukupkan dengan
metanol sampai garis tanda. Diamkan di tempat gelap selama 60 menit, lalu diukur serapannya menggunakan spektrofotometer uv-visibel pada panjang
gelombang 516 nm.
Larutan vitamin C
Sebanyak 25 mg serbuk vitamin C ditimbang, dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml dilarutkan dengan metanol sampai garis tanda, diperoleh larutan
induk baku vitamin C konsentrasi 1000 ppm.
