3.2.5.2. Spesifisitas Substrat Sumardi 2005
Sebanyak 0,1 gram substrat kompleks PKM, SBM, dan CM masing- masing dimasukkan ke dalam tabung mikro kemudian ditambahkan 900 µl bufer
dengan pH optimum yang telah diketahui dari percobaan sebelumnya dan 100 µl enzim. Campuran enzim-subtrat kemudian direaksikan pada suhu optimumnya
selama 1 jam. Kadar gula reduksi yang dihasilkan diukur menggunakan DNS seperti yang telah dijelaskan sebelumnya.
3.2.5.3. Pengujian Pengaruh Ion Logam Sumardi 2005
Pengaruh ion logam dilakukan dengan menambahkan larutan garam CuCl
2 .
2H
2
O; LiCl; CoCl
2 .
7H
2
O; MgCl
2 .
6H
2
O; FeCl
3 .
6H
2
O; NaCl; KCl; dan senyawa pengkelat logam, yaitu EDTA pada campuran reaksi enzim-substrat
dengan komposisi 850 µl substrat LBG 0,55, 100 µl enzim, dan 50 µl ion logam 100 mM kemudian direaksikan pada pH bufer dan suhu optimum enzim. Kadar
gula reduksi yang dihasilkan diukur menggunakan DNS seperti yang telah
dijelaskan sebelumnya. 3.2.5.4. Pengujian Kestabilan Enzim terhadap Suhu
Enzim mananase diinkubasi pada suhu 50, 60, dan 70
o
C dengan waktu sampling setiap 1 jam sekali selama 4 jam. Selanjutnya enzim dicampur substrat
dengan komposisi 900 µl substrat LBG 0,55 dan 100 µl enzim, kemudian direaksikan pada pH bufer dan suhu optimumnya selama 1 jam dan kadar gula
reduksi yang dihasilkan diukur dengan metode DNS.
3.2.5.5. Pengujian Kestabilan Enzim terhadap pH
Kestabilan enzim pada berbagai pH diuji dengan mencampur enzim mananase pada bufer pH 4,0 sampai 10,0 dengan selang 1,0. Komposisi yang
digunakan adalah 100 µl enzim ekstrak kasar dalam 900 µl bufer. Hasil campuran tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 1 jam. Setelah selesai inkubasi,
masing-masing hasil campuran diambil sebanyak 100 µl dan direaksikan dengan 900 µl substrat LBG 0,55 pada pH bufer dan suhu optimumnya selama 1 jam
dan kadar gula reduksi yang dihasilkan diukur dengan metode DNS.
3.2.5.6. Analisis Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SDS PAGE dan Zymogram
Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan piranti Mini Protean II Biorad, USA. Berat molekul protein diukur dengan standar berat molekul rendah
terdiri atas fosforilase b otot kelinci 97,4 kDa, serum albumin BSA 66,2 kDa, ovalbumin putih telur 45,0 kDa, karbonat anhidrase bovine 31,0 kDa, tripsin
inhibitor kedelai 21,5 kDa, dan lysozyme putih telur 14,4 kDa. Elektroforesis protein menggunakan gel pemisah 8 poliakrilamid dan
gel penahan 4 poliakrilamid. Setelah gel dipasang di piranti elektroforesis, bufer elektroforesis dituangkan ke tempatnya. Sebelum dicampurkan ke dalam
sumur, sampel dan standar protein masing-masing dicampur dengan 5X bufer sampel di dalam tabung mikro dengan perbandingan 1:1 10 µl sampel : 10 µl
bufer. Sampel protein beserta bufer tersebut kemudian dipanaskan pada suhu 95
o
C selama 5 menit. Kemudian sebanyak 20 µl campuran tersebut dimasukkan ke sumur pada gel penahan.
Tabel 1. Komposisi gel pemisah dan penahan untuk sepasang gel elektroforesis protein
Komposisi Gel pemisah ml Gel penahan ml
Akuades 4,8
1,54 Bufer Tris-HCl 1,5 M pH 8,8
2,5 -
Bufer Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 -
0,625 SDS 10
0,05 0,025
Akrilamid 30 2,66
0,67 Ammonium persulfat 10
0,1 0,05
TEMED 0,01
0,01
Elektroforesis dijalankan pada tegangan konstan 80 volt 400 mA selama 2 jam. Gel elektroforesis dilepas dari cetakan dan jarak migrasi bromofenol biru
diukur dari batas atas gel pemisah. Gel SDS PAGE diwarnai dengan metode pewarnaan coomasie brilliant blue CBB. Gel direndam dalam larutan CBB
selama 30 menit. Larutan CBB kemudian dibuang dan dilakukan pencucian
menggunakan larutan pencuci. Larutan pencuci diganti dengan yang baru setiap kali dirasa warna larutan mulai menjadi pekat. Hal ini dilakukan sampai pita
protein muncul dan cukup jelas untuk diamati. Pengujian zymogram cara kerjanya sama dengan yang dilakukan pada saat
elektroforesis untuk SDS PAGE, hanya saja komposisi gel yang digunakan dalam zymogram mengandung substrat LBG yang berfungsi untuk mendeteksi lokasi
enzim mananase berada. Setelah running zymogram selesai, jarak migrasi bromofenol biru diukur dan gel zymogram kemudian direnaturasi untuk
menghilangkan SDS denaturan menggunakan Triton X-100 2,5. Dalam melakukan renaturasi, mula-mula gel direndam 3 kali dalam larutan Triton X-100
2,5, masing-masing selama 20 menit dan diinkubasi bergoyang dengan kecepatan 30 rpm. Setelah itu, gel diinkubasi dalam pH bufer dan suhu
optimumnya selama 1 jam. Untuk memunculkan pita protein mananase, gel diwarnai dengan larutan congo red 0,1 selama 20 menit pada suhu ruang
kemudian dicuci dengan larutan NaCl 1 M. Tabel 2. Komposisi gel pemisah dan penahan untuk sepasang gel zymogram
Komposisi Gel pemisah ml Gel penahan ml
Akuades 2,8
1,54 Substrat LBG 0,5
2,0 -
Bufer Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 2,5
- Bufer Tris-HCl 0,5 M pH 6,8
- 0,625
SDS 10 0,05
0,025 Akrilamid 30
2,66 0,67
Ammonium persulfat 10 0,1
0,05 TEMED
0,01 0,01
3.2.6. Ekstraksi Genom Bakteri Promega, USA
Ekstraksi genom bakteri dilakukan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification kit Promega, USA. Isolat bakteri ditumbuhkan selama 1 malam
pada 37
o
C, 150 rpm di dalam 5 ml media Luria-Broth LB. Larutan kemudian
diambil sebanyak 1 ml dan disentrifugasi 16.000 g selama 2 menit. Supernatan yang diperoleh kemudian dibuang dan pelet bakteri dilarutkan dalam 480 µl
EDTA 50 mM. Setelah itu ditambahkan dengan 120 µl lysozyme dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 45 menit. Campuran kemudian disentrifugasi 16.000 g selama 2 menit dan supernatannya dibuang. Endapan yang diperoleh kemudian
diresuspensi dengan 600 µl larutan lisis nukleus dan diinkubasi pada 80
o
C selama 5 menit. Setelah suhu campuran tersebut kembali pada suhu ruang, ditambahkan
dengan 3 µl RNAse dan diinkubasi pada suhu 37
o
C, selama 30 menit. Campuran tersebut kemudian ditambahkan dengan 200 µl larutan presipitasi protein dan
diinkubasi di dalam es selama 5 menit kemudian dilakukan sentrifugasi pada 16.000 g selama 3 menit. Supernatan yang diperoleh kemudian dipindahkan ke
tabung mikro baru yang berisi 600 µl isopropanol, kemudian disentrifugasi kembali pada 16.000 g selama 2 menit dan supernatannya dibuang. Pelet yang
diperoleh kemudian ditambahkan dengan 600 µ l etanol 70, disentrifugasi 16.000 g selama 2 menit dan supernatannya dibuang. Kali ini, pelet yang
diperoleh dikering anginkan selama 15 menit, kemudian ditambahkan dengan 50 µl larutan bufer rehidrasinya.
3.2.7. Analisis Sekuen rRNA 16S Marchesi et al. 1998
Larutan DNA genom bakteri yang diperoleh kemudian diencerkan menjadi 100 ngµl kemudian dilakukan PCR menggunakan primer 63f dan 1387r yang
akan mengamplifikasi fragmen berukuran sekitar 1324 pasang basa dari gen 16S rRNA. Denaturasi awal dilakukan pada 96
o
C selama 5 menit dilanjutkan dengan 29 siklus yang terdiri dari denaturasi 96
o
C 30 detik, annealing pada 56
o
C 30 detik, dan extension pada 72
o
C 1,5 menit, dan extension akhir pada 72
o
C selama 7 menit. Hasil amplifikasi sekuen 16S rRNA kemudian dielektroforesis
untuk mengkonfirmasi hasilnya. Sekuen 16S rRNA tersebut kemudian dianalisa dan dibandingkan dengan sekuen DNA yang ada di GeneBank menggunakan
program BLAST.
3.2.8. Isolasi Gen Mananase Summpunn et al. 2011
Larutan DNA genom bakteri yang sudah diencerkan menjadi 100 ngµl kemudian dicoba untuk diisolasi gen mananasenya menggunakan PCR. Primer
yang digunakan adalah Man- CHF 5’-GTACGCCATATGTTTAAGAAACATAC
GATCTCTTTGC- 3’ dan Man-CHR 5’-GTACGCCTCGAGTTCAACGATTGG
CGTTAAAGAATC- 3’. Kondisi PCR yang digunakan adalah denaturasi awal
pada 98
o
C selama 30 detik dilanjutkan dengan 29 siklus yang terdiri dari denaturasi 98
o
C 10 detik, annealing pada 52
o
C 30 detik, dan extension pada 72
o
C 30 detik, dan extension akhir pada 72
o
C selama 5 menit.
3.2.9. Ligasi ke Dalam pGEMT-easy Promega, USA
Setelah diperoleh gen mananase, gen ini kemudian diligasikan ke dalam vektor kloning yaitu pGEMT-easy. Konsentrasi vektor yang digunakan adalah 50
ngµl. Ligasi dilakukan dengan bantuan enzim T4 DNA ligase. Campuran vektor dan insert kemudian diinkubasi pada suhu 16
o
C selama 1 malam.
3.2.10. Transformasi Promega, USA
Sebanyak 10 µl hasil ligasi dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi 100 µl sel E. coli TOP10 kompeten. Campuran ini kemudian diinkubasi di dalam
es selama 1-1,5 jam dan setiap 15 menit sekali digoyang perlahan. Setelah itu, dilakukan heat shock pada 42
o
C selama 90 detik di dalam waterbath. Sel kompeten kemudian segera dimasukkan kembali ke dalam es selama 2-3 menit.
Kemudian sebanyak 800 µl LB steril ditambahkan ke dalam tabung mikro dan sel kompeten kemudian diinkubasi sambil digoyang perlahan posisi tabung mikro
horisontal pada 37
o
C selama 1 jam. Sel transforman kemudian disentrifugasi pada kecepatan 2.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang
hingga bersisa sekitar 150 µl di dalam tabung mikro. Pelet bakteri kemudian diresuspensi dan disebar masing-masing sebanyak 50 dan 100 µl pada media
Luria Agar yang mengandung Ampicilin dan X-gal. Cawan kemudian diinkubasi
Kategori