menggunakan larutan pencuci. Larutan pencuci diganti dengan yang baru setiap kali dirasa warna larutan mulai menjadi pekat. Hal ini dilakukan sampai pita
protein muncul dan cukup jelas untuk diamati. Pengujian zymogram cara kerjanya sama dengan yang dilakukan pada saat
elektroforesis untuk SDS PAGE, hanya saja komposisi gel yang digunakan dalam zymogram mengandung substrat LBG yang berfungsi untuk mendeteksi lokasi
enzim mananase berada. Setelah running zymogram selesai, jarak migrasi bromofenol biru diukur dan gel zymogram kemudian direnaturasi untuk
menghilangkan SDS denaturan menggunakan Triton X-100 2,5. Dalam melakukan renaturasi, mula-mula gel direndam 3 kali dalam larutan Triton X-100
2,5, masing-masing selama 20 menit dan diinkubasi bergoyang dengan kecepatan 30 rpm. Setelah itu, gel diinkubasi dalam pH bufer dan suhu
optimumnya selama 1 jam. Untuk memunculkan pita protein mananase, gel diwarnai dengan larutan congo red 0,1 selama 20 menit pada suhu ruang
kemudian dicuci dengan larutan NaCl 1 M. Tabel 2. Komposisi gel pemisah dan penahan untuk sepasang gel zymogram
Komposisi Gel pemisah ml Gel penahan ml
Akuades 2,8
1,54 Substrat LBG 0,5
2,0 -
Bufer Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 2,5
- Bufer Tris-HCl 0,5 M pH 6,8
- 0,625
SDS 10 0,05
0,025 Akrilamid 30
2,66 0,67
Ammonium persulfat 10 0,1
0,05 TEMED
0,01 0,01
3.2.6. Ekstraksi Genom Bakteri Promega, USA
Ekstraksi genom bakteri dilakukan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification kit Promega, USA. Isolat bakteri ditumbuhkan selama 1 malam
pada 37
o
C, 150 rpm di dalam 5 ml media Luria-Broth LB. Larutan kemudian
diambil sebanyak 1 ml dan disentrifugasi 16.000 g selama 2 menit. Supernatan yang diperoleh kemudian dibuang dan pelet bakteri dilarutkan dalam 480 µl
EDTA 50 mM. Setelah itu ditambahkan dengan 120 µl lysozyme dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 45 menit. Campuran kemudian disentrifugasi 16.000 g selama 2 menit dan supernatannya dibuang. Endapan yang diperoleh kemudian
diresuspensi dengan 600 µl larutan lisis nukleus dan diinkubasi pada 80
o
C selama 5 menit. Setelah suhu campuran tersebut kembali pada suhu ruang, ditambahkan
dengan 3 µl RNAse dan diinkubasi pada suhu 37
o
C, selama 30 menit. Campuran tersebut kemudian ditambahkan dengan 200 µl larutan presipitasi protein dan
diinkubasi di dalam es selama 5 menit kemudian dilakukan sentrifugasi pada 16.000 g selama 3 menit. Supernatan yang diperoleh kemudian dipindahkan ke
tabung mikro baru yang berisi 600 µl isopropanol, kemudian disentrifugasi kembali pada 16.000 g selama 2 menit dan supernatannya dibuang. Pelet yang
diperoleh kemudian ditambahkan dengan 600 µ l etanol 70, disentrifugasi 16.000 g selama 2 menit dan supernatannya dibuang. Kali ini, pelet yang
diperoleh dikering anginkan selama 15 menit, kemudian ditambahkan dengan 50 µl larutan bufer rehidrasinya.
3.2.7. Analisis Sekuen rRNA 16S Marchesi et al. 1998
Larutan DNA genom bakteri yang diperoleh kemudian diencerkan menjadi 100 ngµl kemudian dilakukan PCR menggunakan primer 63f dan 1387r yang
akan mengamplifikasi fragmen berukuran sekitar 1324 pasang basa dari gen 16S rRNA. Denaturasi awal dilakukan pada 96
o
C selama 5 menit dilanjutkan dengan 29 siklus yang terdiri dari denaturasi 96
o
C 30 detik, annealing pada 56
o
C 30 detik, dan extension pada 72
o
C 1,5 menit, dan extension akhir pada 72
o
C selama 7 menit. Hasil amplifikasi sekuen 16S rRNA kemudian dielektroforesis
untuk mengkonfirmasi hasilnya. Sekuen 16S rRNA tersebut kemudian dianalisa dan dibandingkan dengan sekuen DNA yang ada di GeneBank menggunakan
program BLAST.
