diperoleh akan digunakan sebagai suhu optimum reaksi enzim-substrat dalam percobaan-percobaan selanjutnya.
3.2.4. Pengukuran Kadar Protein Novagen, USA
Pengukuran kadar protein dilakukan dengan menggunakan kit dari Novagen USA. Sampel enzim ekstrak kasar diambil sebanyak 25 µl kemudian
ditambahkan ke dalam 200 µl larutan asam bicinchoninat dan 4 µl CuSO
4
4, divortex, diinkubasi pada suhu 60
o
C selama 15 menit. Absorbansi larutan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 562 nm. Dibuat juga
blanko dengan menggunakan akuades. Standar yang digunakan adalah Bovine Serum Albumine BSA. Aktivitas spesifik enzim didefinisikan sebagai besarnya
aktivitas unit enzim per miligram protein.
3.2.5. Karakterisasi Enzim Mananase Sumardi et al. 2006, dengan
modifikasi 3.2.5.1. Penentuan pH Optimum Bufer
Penentuan pH optimum bufer dilakukan dengan menguji aktivitas enzim pada pH 4-10 pada suhu optimum enzim yang diketahui dari percobaan
sebelumnya. Bufer yang digunakan adalah bufer sitrat untuk pH 4-8 Asam sitrat + Na
2
HPO
4
dan bufer borat untuk pH 9-10 Na tetra borat + NaOH. Sebanyak 100 µl enzim ekstrak kasar direaksikan masing-masing dengan 900 µl LBG
0,55 yang sudah dikondisikan pada pH 4-10. Campuran enzim-subtrat kemudian direaksikan pada suhu optimumnya selama 1 jam. Kadar gula reduksi
yang dihasilkan diukur menggunakan DNS seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. pH optimum bufer yang diperoleh akan digunakan sebagai pH
optimum bufer untuk percobaan-percobaan selanjutnya.
3.2.5.2. Spesifisitas Substrat Sumardi 2005
Sebanyak 0,1 gram substrat kompleks PKM, SBM, dan CM masing- masing dimasukkan ke dalam tabung mikro kemudian ditambahkan 900 µl bufer
dengan pH optimum yang telah diketahui dari percobaan sebelumnya dan 100 µl enzim. Campuran enzim-subtrat kemudian direaksikan pada suhu optimumnya
selama 1 jam. Kadar gula reduksi yang dihasilkan diukur menggunakan DNS seperti yang telah dijelaskan sebelumnya.
3.2.5.3. Pengujian Pengaruh Ion Logam Sumardi 2005
Pengaruh ion logam dilakukan dengan menambahkan larutan garam CuCl
2 .
2H
2
O; LiCl; CoCl
2 .
7H
2
O; MgCl
2 .
6H
2
O; FeCl
3 .
6H
2
O; NaCl; KCl; dan senyawa pengkelat logam, yaitu EDTA pada campuran reaksi enzim-substrat
dengan komposisi 850 µl substrat LBG 0,55, 100 µl enzim, dan 50 µl ion logam 100 mM kemudian direaksikan pada pH bufer dan suhu optimum enzim. Kadar
gula reduksi yang dihasilkan diukur menggunakan DNS seperti yang telah
dijelaskan sebelumnya. 3.2.5.4. Pengujian Kestabilan Enzim terhadap Suhu
Enzim mananase diinkubasi pada suhu 50, 60, dan 70
o
C dengan waktu sampling setiap 1 jam sekali selama 4 jam. Selanjutnya enzim dicampur substrat
dengan komposisi 900 µl substrat LBG 0,55 dan 100 µl enzim, kemudian direaksikan pada pH bufer dan suhu optimumnya selama 1 jam dan kadar gula
reduksi yang dihasilkan diukur dengan metode DNS.
3.2.5.5. Pengujian Kestabilan Enzim terhadap pH
Kestabilan enzim pada berbagai pH diuji dengan mencampur enzim mananase pada bufer pH 4,0 sampai 10,0 dengan selang 1,0. Komposisi yang
digunakan adalah 100 µl enzim ekstrak kasar dalam 900 µl bufer. Hasil campuran tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 1 jam. Setelah selesai inkubasi,
masing-masing hasil campuran diambil sebanyak 100 µl dan direaksikan dengan 900 µl substrat LBG 0,55 pada pH bufer dan suhu optimumnya selama 1 jam
dan kadar gula reduksi yang dihasilkan diukur dengan metode DNS.
