pada suhu 37
o
C, selama 1 malam. Koloni transforman yang tumbuh kemudian diambil dan dimurnikan pada media yang baru. Untuk memastikan bahwa bakteri
transforman tersebut membawa gen mananase yang diinginkan maka dilakukan verifikasi menggunakan PCR koloni. Primer yang digunakan adalah M13 forward
dan M13 reverse. Kondisi PCR yang digunakan adalah denaturasi awal pada 95
o
C selama 5 menit dilanjutkan dengan 29 siklus yang terdiri dari denaturasi 95
o
C 30 detik, annealing pada 50
o
C 30 detik, dan extension pada 72
o
C 2 menit, dan extension akhir pada 72
o
C selama 5 menit.
3.2.11. Pengujian Aktivitas Mananase Intraseluler Sumardi et al. 2005,
dengan modifikasi
Pelet sel bakteri yang diperoleh dari hasil produksi enzim dicuci menggunakan bufer dengan pH optimum untuk kerja enzimnya sebanyak tiga kali
dan setiap kali disentrifugasi pada 17.000 g selama 2 menit. Sel bakteri yang sudah dicuci kemudian ditambahkan 1 ml bufer dan dipecah selnya menggunakan
sonicator Tomy, Japan selama 2 x 2 menit. Larutan kemudian disentrifugasi sekali lagi pada 17.000 g selama 2 menit dan supernatan yang diperoleh
dipindahkan ke dalam tabung mikro yang baru. Supernatan ini kemudian diuji aktivitas mananasenya menggunakan substrat LBG 0,55. Sebanyak 20 µl
supernatan direaksikan dengan 980 µl LBG 0,55 pada pH bufer dan suhu optimumnya selama 1 jam. Kadar gula reduksi yang dihasilkan diukur
menggunakan DNS seperti yang telah dijelaskan sebelumnya.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Screening Bakteri Penghasil Mananase
Dalam penelitian ini digunakan sampel tempe dari beberapa daerah di pulau Jawa, yaitu: Bogor, Wonogiri, Surabaya, Malang, Kediri, dan Lamongan.
Dari proses screening diperoleh tujuh isolat bakteri yang memiliki aktivitas mananase berdasarkan zona bening yang dihasilkan di sekitar koloninya. Dari
ketujuh bakteri tersebut kemudian dimurnikan dan dipilih empat isolat yang diduga memiliki aktivitas mananase paling bagus ditandai dengan zona bening
yang jelas dan besar di sekeliling koloninya. Keempat isolat tersebut diberi kode A, D, E, dan N. Zona bening yang besar mengindikasikan konsentrasi enzim yang
dihasilkan oleh bakteri juga tinggi Farias et al. 2010. Namun, tidak dijelaskan mengenai kualitas enzim yang dihasilkan tersebut. Oleh karena itu, keempat isolat
tersebut diuji aktivitas enzim yang dihasilkannya terlebih dahulu sebelum dipilih isolat terbaik untuk dikarakterisasi lebih lanjut.
Tabel 3. Indeks mananolitik isolat A, D, E, dan N
Isolat Diameter
Koloni cm Diameter Zona
Bening cm Indeks
Mananolitik Asal
Tempe
A 0,25
0,55 1,20
Bogor D
0,15 0,75
4,00 Bogor
E 0,30
0,75 1,50
Bogor N
0,15 0,55
2,67 Wonogiri
Gambar 4. Kenampakan zona bening yang dihasilkan oleh isolat A, D, E, dan N ketika ditumbuhkan pada media agar mengandung LBG 0,3 24
jam, 37
o
C
