3.2.5.6. Analisis Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SDS PAGE dan Zymogram
Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan piranti Mini Protean II Biorad, USA. Berat molekul protein diukur dengan standar berat molekul rendah
terdiri atas fosforilase b otot kelinci 97,4 kDa, serum albumin BSA 66,2 kDa, ovalbumin putih telur 45,0 kDa, karbonat anhidrase bovine 31,0 kDa, tripsin
inhibitor kedelai 21,5 kDa, dan lysozyme putih telur 14,4 kDa. Elektroforesis protein menggunakan gel pemisah 8 poliakrilamid dan
gel penahan 4 poliakrilamid. Setelah gel dipasang di piranti elektroforesis, bufer elektroforesis dituangkan ke tempatnya. Sebelum dicampurkan ke dalam
sumur, sampel dan standar protein masing-masing dicampur dengan 5X bufer sampel di dalam tabung mikro dengan perbandingan 1:1 10 µl sampel : 10 µl
bufer. Sampel protein beserta bufer tersebut kemudian dipanaskan pada suhu 95
o
C selama 5 menit. Kemudian sebanyak 20 µl campuran tersebut dimasukkan ke sumur pada gel penahan.
Tabel 1. Komposisi gel pemisah dan penahan untuk sepasang gel elektroforesis protein
Komposisi Gel pemisah ml Gel penahan ml
Akuades 4,8
1,54 Bufer Tris-HCl 1,5 M pH 8,8
2,5 -
Bufer Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 -
0,625 SDS 10
0,05 0,025
Akrilamid 30 2,66
0,67 Ammonium persulfat 10
0,1 0,05
TEMED 0,01
0,01
Elektroforesis dijalankan pada tegangan konstan 80 volt 400 mA selama 2 jam. Gel elektroforesis dilepas dari cetakan dan jarak migrasi bromofenol biru
diukur dari batas atas gel pemisah. Gel SDS PAGE diwarnai dengan metode pewarnaan coomasie brilliant blue CBB. Gel direndam dalam larutan CBB
selama 30 menit. Larutan CBB kemudian dibuang dan dilakukan pencucian
menggunakan larutan pencuci. Larutan pencuci diganti dengan yang baru setiap kali dirasa warna larutan mulai menjadi pekat. Hal ini dilakukan sampai pita
protein muncul dan cukup jelas untuk diamati. Pengujian zymogram cara kerjanya sama dengan yang dilakukan pada saat
elektroforesis untuk SDS PAGE, hanya saja komposisi gel yang digunakan dalam zymogram mengandung substrat LBG yang berfungsi untuk mendeteksi lokasi
enzim mananase berada. Setelah running zymogram selesai, jarak migrasi bromofenol biru diukur dan gel zymogram kemudian direnaturasi untuk
menghilangkan SDS denaturan menggunakan Triton X-100 2,5. Dalam melakukan renaturasi, mula-mula gel direndam 3 kali dalam larutan Triton X-100
2,5, masing-masing selama 20 menit dan diinkubasi bergoyang dengan kecepatan 30 rpm. Setelah itu, gel diinkubasi dalam pH bufer dan suhu
optimumnya selama 1 jam. Untuk memunculkan pita protein mananase, gel diwarnai dengan larutan congo red 0,1 selama 20 menit pada suhu ruang
kemudian dicuci dengan larutan NaCl 1 M. Tabel 2. Komposisi gel pemisah dan penahan untuk sepasang gel zymogram
Komposisi Gel pemisah ml Gel penahan ml
Akuades 2,8
1,54 Substrat LBG 0,5
2,0 -
Bufer Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 2,5
- Bufer Tris-HCl 0,5 M pH 6,8
- 0,625
SDS 10 0,05
0,025 Akrilamid 30
2,66 0,67
Ammonium persulfat 10 0,1
0,05 TEMED
0,01 0,01
3.2.6. Ekstraksi Genom Bakteri Promega, USA
Ekstraksi genom bakteri dilakukan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification kit Promega, USA. Isolat bakteri ditumbuhkan selama 1 malam
pada 37
o
C, 150 rpm di dalam 5 ml media Luria-Broth LB. Larutan kemudian
Kategori