proses transformasi sudah berjalan dengan benar, maka koloni transforman yang tumbuh diambil dan dilakukan PCR koloni. Untuk selanjutnya E. coli transforman
ini disebut sebagai SEGO1 E. coli TOP10 yang membawa pWBE1.
Gambar 12. Hasil elektroforesis produk PCR gen mananase menggunakan primer Man-CHF dan Man-CHR.
Gambar 13. pWBE1 pGEMT-easy yang sudah disisipi dengan gen mananase dari
B. subtilis N
100 bp N
500 bp 1000 bp
+ 1100 bp
manA dari B. subtilis N
4.10. Perbandingan Aktivitas Mananase B. subtilis N dengan SEGO1
SEGO1 kemudian ditumbuhkan untuk produksi enzim mananase dan dibandingkan aktivitasnya dengan B. subtilis N. Hasil perbandingan aktivitas
mananase tersaji dalam Tabel 4. Dari data tersebut dapat terlihat bahwa SEGO1 dapat menghasilkan enzim mananase dengan aktivitas yang tidak berbeda jauh
bila dibandingkan dengan yang dihasilkan oleh B. subtilis N. Aktivitas mananase juga ditemukan pada cairan intraseluler SEGO1. Hal ini diduga disebabkan masih
kurangnya kemampuan SEGO1 untuk mengeluarkan enzim mananase yang sudah diekspresikan dari dalam selnya. Rekayasa mikroorganisme agar menghasilkan
enzim mananase dengan aktivitas yang tinggi telah dilakukan beberapa peneliti seperti Summpunn et al. 2011, Vu et al. 2012, dan Yoon et al. 2008.
Mikroorganisme yang umumnya digunakan adalah bakteri atau khamir. Karakterisasi enzim mananase yang dihasilkan oleh mikroorganisme rekombinan
tersebut juga telah dilakukan. Tabel 4. Perbandingan aktivitas unit mananase B. subtilis N dengan SEGO1
pada substrat LBG 0,55
Sampel Aktivitas Unit Uml
B. subtilis N ekstraseluler 7,66
B. subtilis N intraseluler 50 ml1 ml 0,02
SEGO1 ekstraseluler 6,39
SEGO1 intraseluler 50 ml1 ml 8,82
E. coli pGEMT-easy 0,02
4.11. SDS PAGE dan Zymogram
Untuk melihat profil protein yang dihasilkan oleh B. subtilis N maupun SEGO1 maka dilakukan analisa protein menggunakan SDS PAGE. Hasil analisa
menunjukkan bahwa protein ekstraseluler B. subtilis N memiliki dua pita protein yang paling tebal. Kedua pita protein ini memiliki berat molekul sekitar 47,3 dan
39,8 kilodalton kDa. Sedangkan untuk protein intraseluler dari B. subtilis N hanya ada satu pita protein yang cukup tebal berukuran sekitar 47,3 kDa.
Sementara itu, hasil analisa SDS PAGE terhadap protein ekstraseluler SEGO1 juga menghasilkan pita protein dengan ukuran 47,3 dan 39,8 kDa, tetapi tidak
sejelas B. subtilis N. Sedangkan untuk profil protein intraseluler SEGO1 terlihat
ada beberapa pita yang cukup tebal. Untuk mengetahui pita protein manakah yang memiliki aktivitas mananase maka dilakukan analisa zymogram. Berdasarkan
analisa zymogram ini diketahui bahwa protein yang berukuran sekitar 39,8 kDa lah yang merupakan enzim mananase. Hasil zymogram menunjukkan tidak
adanya aktivitas mananase di dalam sel B. subtilis N, tetapi pada SEGO1, aktivitas mananase ditemukan baik pada cairan ekstra- maupun intraselulernya.
Hal ini sesuai pula dengan data-data aktivitas enzim yang sudah diperoleh sebelumnya. Hasil analisa menggunakan SDS PAGE dan zymogram ini
menunjukkan pula bahwa enzim mananase yang dihasilkan merupakan protein monomer yang memiliki kemiripan dengan mananase yang dihasilkan oleh
mikroorganisme yang lain, kecuali
Bacillus stearothermophilus yang menghasilkan dimer Talbot Sygusch 1990.
Gambar 14. Hasil SDS PAGE dan zymogram protein ekstra- dan intraseluler dari B. subtilis N dan SEGO1
Keterangan gambar: M = Marker
I dan V = protein ekstraseluler B. subtilis N II dan VI = protein intraseluler B. subtilis N
III dan VII = protein ekstraseluler SEGO1 IV dan VIII = protein intraseluler SEGO1
M I II III IV kDa
SDS PAGE Zymogram
97,4 66,2
45,0
31,0 + 47,3
+ 39,8 kDa
V VI VII VIII
