3.2.8. Isolasi Gen Mananase Summpunn et al. 2011
Larutan DNA genom bakteri yang sudah diencerkan menjadi 100 ngµl kemudian dicoba untuk diisolasi gen mananasenya menggunakan PCR. Primer
yang digunakan adalah Man- CHF 5’-GTACGCCATATGTTTAAGAAACATAC
GATCTCTTTGC- 3’ dan Man-CHR 5’-GTACGCCTCGAGTTCAACGATTGG
CGTTAAAGAATC- 3’. Kondisi PCR yang digunakan adalah denaturasi awal
pada 98
o
C selama 30 detik dilanjutkan dengan 29 siklus yang terdiri dari denaturasi 98
o
C 10 detik, annealing pada 52
o
C 30 detik, dan extension pada 72
o
C 30 detik, dan extension akhir pada 72
o
C selama 5 menit.
3.2.9. Ligasi ke Dalam pGEMT-easy Promega, USA
Setelah diperoleh gen mananase, gen ini kemudian diligasikan ke dalam vektor kloning yaitu pGEMT-easy. Konsentrasi vektor yang digunakan adalah 50
ngµl. Ligasi dilakukan dengan bantuan enzim T4 DNA ligase. Campuran vektor dan insert kemudian diinkubasi pada suhu 16
o
C selama 1 malam.
3.2.10. Transformasi Promega, USA
Sebanyak 10 µl hasil ligasi dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi 100 µl sel E. coli TOP10 kompeten. Campuran ini kemudian diinkubasi di dalam
es selama 1-1,5 jam dan setiap 15 menit sekali digoyang perlahan. Setelah itu, dilakukan heat shock pada 42
o
C selama 90 detik di dalam waterbath. Sel kompeten kemudian segera dimasukkan kembali ke dalam es selama 2-3 menit.
Kemudian sebanyak 800 µl LB steril ditambahkan ke dalam tabung mikro dan sel kompeten kemudian diinkubasi sambil digoyang perlahan posisi tabung mikro
horisontal pada 37
o
C selama 1 jam. Sel transforman kemudian disentrifugasi pada kecepatan 2.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang
hingga bersisa sekitar 150 µl di dalam tabung mikro. Pelet bakteri kemudian diresuspensi dan disebar masing-masing sebanyak 50 dan 100 µl pada media
Luria Agar yang mengandung Ampicilin dan X-gal. Cawan kemudian diinkubasi
pada suhu 37
o
C, selama 1 malam. Koloni transforman yang tumbuh kemudian diambil dan dimurnikan pada media yang baru. Untuk memastikan bahwa bakteri
transforman tersebut membawa gen mananase yang diinginkan maka dilakukan verifikasi menggunakan PCR koloni. Primer yang digunakan adalah M13 forward
dan M13 reverse. Kondisi PCR yang digunakan adalah denaturasi awal pada 95
o
C selama 5 menit dilanjutkan dengan 29 siklus yang terdiri dari denaturasi 95
o
C 30 detik, annealing pada 50
o
C 30 detik, dan extension pada 72
o
C 2 menit, dan extension akhir pada 72
o
C selama 5 menit.
3.2.11. Pengujian Aktivitas Mananase Intraseluler Sumardi et al. 2005,
dengan modifikasi
Pelet sel bakteri yang diperoleh dari hasil produksi enzim dicuci menggunakan bufer dengan pH optimum untuk kerja enzimnya sebanyak tiga kali
dan setiap kali disentrifugasi pada 17.000 g selama 2 menit. Sel bakteri yang sudah dicuci kemudian ditambahkan 1 ml bufer dan dipecah selnya menggunakan
sonicator Tomy, Japan selama 2 x 2 menit. Larutan kemudian disentrifugasi sekali lagi pada 17.000 g selama 2 menit dan supernatan yang diperoleh
dipindahkan ke dalam tabung mikro yang baru. Supernatan ini kemudian diuji aktivitas mananasenya menggunakan substrat LBG 0,55. Sebanyak 20 µl
supernatan direaksikan dengan 980 µl LBG 0,55 pada pH bufer dan suhu optimumnya selama 1 jam. Kadar gula reduksi yang dihasilkan diukur
menggunakan DNS seperti yang telah dijelaskan sebelumnya.
Kategori