Latar Belakang Enzyme Characterization and Cloning of Mannanase Gene from Bacillus subtilis Isolated from Tempe

utama β-1,4-manan, galaktomanan, glukomanan, dan galaktoglukomanan. Struktur utama manan ini terbentuk melalui polimerisasi manosa dengan ikatan β- 1,4; polimerisasi manosa dengan glukosa membentuk glukomanan; dan dapat pula tersubstitusi dengan gugus samping galaktosil melalui ikatan α-1,6 membentuk struktur galaktomanan. Manan sendiri dapat ditemukan pada biji dan dinding sel berbagai tanaman, termasuk tanaman kacang-kacangan. Dalam penelitian oleh Hsiao et al . 2006 dilaporkan mengenai kandungan β-manan yang berupa galaktomanan dalam pakan ternak yang berasal dari kedelai. Penggunaan enzim mananase bersama dengan dua jenis enzim yang lain dilaporkan dapat memecah galaktomanan secara sempurna menghasilkan manosa dan galaktosa Fattah et al. 2009. Mananase juga cukup menarik perhatian karena fungsi dan aplikasinya pada berbagai industri, termasuk teknologi pangan, seperti pemrosesan biji kopi, alga laut, dan bahan nabati lainnya. Enzim ini dapat digunakan untuk menghidrolisis manan yang memiliki berat molekul tinggi dan pada industri pakan, mananase dapat digunakan untuk meningkatkan kecernaan dari pakan ternak. Mananase juga dapat diaplikasikan pada bidang lain seperti industri tekstil dan pulp biobleaching Rattanasuk Cairns 2009. Dalam bidang peternakan, terutama pakan ayam yang selama ini digunakan umumnya mengandung soybean meal SBM sebagai sumber protein utamanya. SBM mengandung 40 sampai 48 protein kasar, tergantung pada jumlah kulit yang dihilangkan dan cara ekstraksi minyaknya. Bila dibandingkan dengan pakan yang berasal dari ampas ekstraksi minyak dari biji-bijian jenis lainnya, protein kedelai memiliki keseimbangan asam amino essential yang seimbang. Selain itu ketersediaan dan kandungan energi serta asam amino yang ada pada SBM relatif lebih tinggi daripada jenis pakan nabati lainnya. Dalam biji kedelai mentah terdapat beberapa faktor anti nutrisi, misalnya inhibitor protease yang dapat mempengaruhi daya cerna dan penyerapannya. Namun, selama proses pembuatan SBM, enzim-enzim inhibitor ini sudah mengalami denaturasi Ravindran 2011. Kendala yang masih tertinggal adalah adanya kandungan β- manan dalam SBM. Kandunga n β-manan dalam SBM yang telah dihilangkan kulit arinya dilaporkan berkisar 1,02 sampai 1,51, sedangkan yang belum dihilangkan kulit arinya memiliki kandungan sekitar 1,33 sampai 2,14 Hsiao et al . 2006. β-manan diketahui dapat menstimulasi sistem ketahanan tubuh unggas sehingga mengakibatkan pemborosan energi dalam tubuhnya Dale et al. 2008. Dalam Wu et al. 2005, disebutkan bahwa β-manan juga secara signifikan mengurangi pertumbuhan serta meningkatkan ratio pakan : daging pada ternak. Pemanfaatan enzim β-mananase telah dilaporkan dapat memperbaiki berbagai kekurangan tersebut serta meningkatkan ketersediaan energi dan protein bagi pertumbuhan unggas. Selain SBM, palm kernel meal PKM dan copra meal CM juga telah dimanfaatkan secara luas sebagai pakan ternak. PKM dan CM merupakan limbah dari proses ekstraksi minyak inti kelapa sawit dan kelapa. Diketahui melalui beberapa penelitian bahwa kandungan manan dalam PKM adalah sekitar 20-40 Yopi et al. 2006, sedangkan pada CM sekitar 25-30 Sundu Dingle 2003. Pemanfaatan enzim mananase pada PKM dan CM juga diharapkan dapat memberikan efek yang menguntungkan bagi pertumbuhan ternak, seperti halnya pada SBM. Beberapa penelitian yang telah dilakukan menyebutkan bahwa enzim mananase dapat dihasilkan oleh khamir, kapang dari golongan Trichoderma dan Aspergillus Fattah et al. 2009, serta bakteri terutama dari golongan Bacillus Phothichitto et al. 2006; Mabrouk Ahwany 2008; Xu et al. 2009. Enzim β- mananase komersial yang sejauh ini telah dipasarkan dihasilkan oleh Bacillus lentus Wu et al. 2005. Pada pembuatan tempe, komunitas mikroorganisme yang berperan sangat banyak. Disebutkan dalam Agranoff 2001 bahwa ada sekitar 45 galur Rhizopus, 200 spesies bakteri, dan 20 spesies khamir yang pernah diisolasi dari berbagai sampel tempe yang ada di Jawa, Sumatra, dan Bali. Berbagai spesies mikroorganisme tersebut saling bekerjasama dalam menghasilkan produk tempe yang berkualitas. Beberapa contoh bakteri yang memiliki peran penting dalam proses pembuatan tempe adalah Brevibacterium epidermides, Micrococcus luteus, Microbacterium arborescens yang berperan dalam pembentukan antioksidan faktor II 6,7,4’ trihydroxy isoflavon; Klebsiella pneumoniae dan Citrobacter freundii yang berperan dalam sintesa vitamin B 12 ; serta berbagai jenis bakteri lain yang berperan dalam pembentukan flavor dan aroma tempe. Komunitas bakteri yang berperan dalam pembentukan rasa pahit pada tempe dan dapat dikulturkan telah diteliti dalam Barus et al. 2008. Bakteri tersebut antara lain Bacillus sp, Klebsiella sp, Brevundimonas sp, Pseudomonas putilda, dan Acinetobacter sp. Komunitas bakteri yang sangat beragam pada tempe ini, terutama dari golongan Bacillus, memiliki potensi untuk diteliti dan dikembangkan kemampuan menghasilkan enzim mananasenya. Produksi enzim untuk skala industri umumnya menggunakan mikroorganisme yang sudah direkayasa sehingga dapat memproduksi enzim yang diinginkan dalam jumlah besar. Tahapan awal yang diperlukan untuk melakukan proses rekayasa tersebut adalah mengisolasi gen penyandi enzim dan kemudian dilakukan kloning. Salah satu mikroorganisme yang umum digunakan dalam proses kloning adalah E. coli. Dalam laporan penelitian terdahulu seperti Fu et al. 2010 dan Summpunn et al. 2011 telah berhasil dilakukan kloning gen penyandi mananase ke dalam E. coli.

1.2. Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri penghasil mananase dari beberapa sampel tempe yang ada di pulau Jawa, kemudian melakukan karakterisasi enzimnya, dan melakukan kloning gen penyandi mananase ke dalam E. coli. BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tempe Kedelai

Tempe merupakan salah satu produk fermentasi kedelai oleh kapang Rhizopus oligosporus. Jenis makanan ini sudah diproduksi sejak beberapa abad yang lalu di Indonesia dan hingga sekarang masih menjadi salah satu bahan pangan yang utama sekaligus sumber protein yang murah bagi masyarakatnya. Berbeda dengan produk olahan fermentasi kedelai lainnya, produksi tempe hanya tersebar di beberapa negara, termasuk Malaysia, Belanda, Kanada, dan Amerika. Namun, Indonesia sampai saat ini masih merupakan produsen sekaligus konsumen utama tempe. Konsumsi tempe per kapita di Indonesia diperkirakan sebesar 15 gramoranghari. Produksi tempe saat ini sudah dapat dibuat dalam skala industri, tetapi mayoritas masih diusahakan dalam skala rumah tangga atau industri kecil Hutkins 2006; Babu et al. 2009. Sebenarnya tempe sendiri baru dikenal dengan baik oleh masyarakat mancanegara, seperti Amerika, sekitar 20 hingga 30 tahun yang lalu. Tempe menjadi bahan pangan yang cukup menarik perhatian mereka dikarenakan dapat menjadi salah satu bahan pangan bagi kaum vegetarian dan sebagai alternatif pengganti daging. Selain itu tempe juga memiliki kandungan nutrisi yang tinggi. Tempe merupakan sumber protein yang baik sebesar 19 dan mengandung vitamin yang jarang ada pada produk pangan nabati, yaitu vitamin B 12 . Menurut data nutrisi USDA, dalam 100 gram sajian tempe yang sudah diolah mengandung 0,14 µg vitamin B 12 . Hal lain yang diperkirakan juga menjadi daya tarik tempe bagi masyarakat luar negeri adalah sifat-sifat organoleptiknya. Tempe segar yang belum diolah memiliki flavor yang lembut serupa jamur. Kemudian setelah diolah akan menghasilkan flavor nutty yang sedap. Bahkan sebagian berpendapat bahwa tempe yang diolah terutama dengan cara digoreng atau ditumis memiliki flavor serupa daging yang dipanggang. Di luar berbagai alasan tersebut, perkembangan tempe di luar negeri dan minat masyarakatnya terhadap tempe ini, tidak terlepas pula dari peran para peneliti seperti Keith Steinkraus, C.W. Hesseltine dan H.L.