18 kawao, 3 Penentuan hubungan perubahan faktor akibat penambahan
kawao terhadap degradasi sukrosa, 4 Penentuan parameter kinetika K
M
dan V
maks
laju degradasi sukrosa akibat penambahan kawao. Diagram alir tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 13.
Gambar 13. Diagram alir tahapan penelitian
a. Penentuan aktivitas invertase
Aktivitas invertase ditentukan untuk mengetahui kondisi awal enzim yang akan digunakan. Aktivitas invertase diperoleh dengan
memplotkan kurva hubungan antara waktu reaksi dengan konsentrasi produk yang terbentuk. Nilai slope yang diperoleh menunjukkan
aktivitas invertase yang diukur. Aktivitas enzim diukur berdasarkan definisi satu unit aktivitas invertase, yaitu banyaknya invertase yang
dapat membebaskan 1 mikromol gula pereduksi dari substrat sukrosa selama 1 menit pada kondisi percobaan. Kondisi yang digunakan yakni
pada kondisi optimum invertase, pada suhu 55°C, di dalam larutan buffer asetat pH 4.5.
19
b. Penentuan pengaruh konsentrasi kawao
Konsentrasi inihibitor akar kawao perlu ditentukan dan disesuaikan dengan komposisi campuran subtrat dan enzim yang akan
digunakan, sehingga diperoleh batas konsentrasi optimum yang dapat terukur melalui kurva standar. Konsentrasi inhibitor yang diperoleh
selanjutnya digunakan untuk karakterisasi invertase dengan penambahan inhibitor. Nilai gula pereduksi yang lebih rendah dari
kontrol perlakuan invertase tanpa inhibitor menunjukkan terjadinya inhibisi. Pengaruh yang berbeda nyata diukur berdasarkan analisis
sidik ragam ANOVA dan uji lanjut Duncan.
c. Penentuan hubungan perubahan faktor akibat penambahan
kawao terhadap degradasi sukrosa.
Perubahan faktor yang dilakukan pada karakterisasi invertase meliputi pengaruh konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu,
dan lama pemanasan dengan ditambahkan kawao. Hasil dari tahap ini didapatkan kurva profil pengaruh perubahan faktor akibat penambahan
kawao terhadap aktivitas invertase. Pengaruh yang diidentifikasi adalah adanya kenaikan atau penurunan konsentrasi gula pereduksi
pada setiap taraf yang diujikan berdasarkan analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan.
d. Penentuan parameter kinetika K
M
dan V
maks
laju degradasi sukrosa akibat penambahan kawao.
Penentuan parameter kinetika dilakukan pada tiga titik suhu yang berbeda 30
o
C, 40
o
C, dan 50
o
C dan pada pH 7, di mana inhibisi akibat penambahan kawao masih terjadi. Model kinetika inhibisi
diidentifikasi berdasarkan jenis perubahan nilai parameter kinetika K
M
dan V
maks
yang diperoleh dari plot Lineweaver-Burk. Pengolahan data sehingga diperoleh model inhibisi yang sesuai serta nilai parameter
kinetika K
M
dan V
maks
dilakukan dengan menggunakan alat bantu
20 program SigmaPlot 2004 for Windows Version 9.01 dari Systat
Software Inc.
2. Prosedur Percobaan
