50 Lampiran 1. Prosedur penelitian tambahan
A. Persiapan larutan buffer asetat 0.05 M, pH 4.5
1. Asam asetat 0.5 M sebanyak 25 ml dimasukkan ke dalam labu takar atau gelas piala 250 ml.
2. Kemudian ditambahkan aquades sebanyak 200 ml. 3. Natrium asetat trihidrat 136.08 gmol sebanyak 0.9567 g ditambahkan ke
dalamnya, kemudian ditera dengan aquades hingga 250 ml. 4. Nilai pH buffer diukur menggunakan pH meter, dan dikoreksi dengan
penambahan larutan HCl 0.1M atau NaOH 0.1M.
B. Persiapan larutan kerja invertase
1. Larutan baku invertase yang setara dengan konsentrasi invertase 1 gl dengan aktivitas 32 unitmg disiapkan dengan cara melarutkan 0.0009 g
invertase Sigma-Aldrich 19253: pH 4.5, 55°C, 355 unitsmg solid pada 10 ml buffer asetat pH 4.5.
2. Kemudian untuk membuat larutan kerja invertase, dilakukan pengenceran dari larutan baku invertase dengan perbandingan 1:100 menggunakan
larutan buffer pH 4.5 sehingga diperoleh larutan kerja invertase dengan konsentrasi yang setara dengan 0.01 gl aktivitas 32 unitmg.
C. Pembuatan kurva standar
1. Kurva standar yang digunakan adalah kurva standar glukosa dan fruktosa. Glukosa dan fruktosa masing-masing 0.0900 g dicampur dan dilarutkan ke
dalam aquades, ditera dalam labu takar 100 ml. 2. Selanjutnya dibuat beberapa konsentrasi larutan glukosa dan fruktosa pada
rentang konsentrasi 0 – 1500 µM 0, 150, 225, 375, 450, 600, 675, 750, 900, 1250, 1500 µM.
3. Pada masing-masing konsentrasi tersebut dimasukkan ke dalamnya DNS dengan perbandingan 1:1.
4. Larutan tersebut dipanaskan dalam waterbath 95°C selama 10 menit kemudian didinginkan dan diukur secara spektrofotometri pada panjang
gelombang 540 nm.
51
D. Penentuan konsentrasi inhibitor optimum
1. Bahan inhibitor akar kawao diiris dan dipotong kecil-kecil kemudian ditumbuk untuk diambil ekstraknya. Ekstrak diperoleh dengan
menambahkan air 1:2 bobot kemudian diperas. 2. Hasil ekstrak di-sentrifuge untuk mengendapkan padatan di dalamnya.
3. Selanjutnya ekstrak inhibitor disiapkan pada rentang konsentrasi yang telah ditentukan pada setiap tabung reaksi 0-0.5 ml.
4. Kemudian ditambahkan ke dalam setiap tabung larutan sukrosa 50 gl sebanyak 0.5 ml dan divortex, volume larutan digenapkan menjadi 1 ml
dengan penambahan aquades. 5. Selanjutnya ditambahkan 1 ml invertase 0,01 gl pada masing-masing
tabung reaksi t = 0 menit. 6. Pada saat t = 5 menit, 2 ml pereaksi DNS dimasukkan untuk menghentikan
reaksi. 7. Kemudian tabung tersebut dimasukkan ke dalam water bath pada suhu
95°C selama 10 menit. 8. Setelah 10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. 9. Berdasarkan data yang diperoleh, ditentukan batas konsentrasi optimum
inhibitor yang memberikan respon inhibisi yang optimal.
52 Lampiran 2. Tabulasi data perbandingan volume masing-masing komponen pada
pengujian faktor pengaruh aktivitas enzim.
Tabel 3. Pengaruh Konsentrasi Enzim
Tabung reaksi
ke- Larutan
invertase 0.01 gl
ml Larutan
buffer pH 7 ml
Larutan sukrosa
50 gl ml
Larutan kawao
ml Konsentrasi
invertase akhir mgl
A 0.00
1.00 1.00
- 0.00
B 0.03
0.97 1.00
- 0.15
C 0.17
0.83 1.00
- 0.85
D 0.33
0.67 1.00
- 1.65
E 0.50
0.50 1.00
- 2.5
F 0.67
0.33 1.00
- 3.35
G 0.83
0.27 1.00
- 4.15
H 1.00
0.00 1.00
- 5.00
A 0.00
0.90 1.00
0.10 0.00
B 0.03
0.87 1.00
0.10 0.15
C 0.17
0.73 1.00
0.10 0.85
D 0.33
0.57 1.00
0.10 1.65
E 0.50
0.40 1.00
0.10 2.5
F 0.67
0.23 1.00
0.10 3.35
G 0.83
0.17 1.00
0.10 4.15
H 0.90
0.00 1.00
0.10 4.50
dengan penambahan kawao
Tabel 4. Pengaruh Konsentrasi Substrat
Tabung reaksi
ke- Larutan
sukrosa 50 gl
ml Aquades
ml Larutan
invertase 0.01 gl
ml Larutan
kawao ml
Konsentrasi sukrosa
akhir gl
A 0.00
1.00 1.00
- 0.00
B 0.17
0.83 1.00
- 4.25
C 0.33
0.67 1.00
- 8.25
D 0.50
0.50 1.00
- 12.50
E 0.67
0.33 1.00
- 16.75
F 0.83
0.27 1.00
- 20.75
G 1.00
0.00 1.00
- 25.00
A 0.00
0.90 1.00
0.10 0.00
B 0.17
0.73 1.00
0.10 4.25
C 0.33
0.57 1.00
0.10 8.25
D 0.50
0.40 1.00
0.10 12.50
E 0.67
0.23 1.00
0.10 16.75
F 0.83
0.17 1.00
0.10 20.75
G 0.90
0.00 1.00
0.10 22.5
dengan penambahan kawao
53
Tabel 5. Pengaruh pH
Tabung reaksi
ke- Larutan invertase
0.01 gl ml
Larutan sukrosa
50 gl ml
Larutan kawao
ml A
1.00 pH = 3 1.00
- B
1.00 pH = 4 1.00
- C
1.00 pH = 5 1.00
- D
1.00 pH = 6 1.00
- E
1.00 pH = 7 1.00
- F
1.00 pH = 8 1.00
- G
1.00 pH = 9 1.00
- H
1.00 pH = 10 1.00
- I
1.00 pH = 11 1.00
- A
1.00 pH = 3 0.90
0.10 B
1.00 pH = 4 0.90
0.10 C
1.00 pH = 5 0.90
0.10 D
1.00 pH = 6 0.90
0.10 E
1.00 pH = 7 0.90
0.10 F
1.00 pH = 8 0.90
0.10 G
1.00 pH = 9 0.90
0.10 H
1.00 pH = 10 0.90
0.10 I
1.00 pH = 11 0.90
0.10
dengan penambahan kawao
Tabel 6. Pengaruh Suhu Inkubasi
Tabung reaksi
ke- Suhu
o
C Larutan
sukrosa 50 gl
ml Larutan
invertase 0.01 gl
ml Aquades
ml Larutan
kawao ml
A 0.50
1.00 0.50
- B
10 0.50
1.00 0.50
- C
20 0.50
1.00 0.50
- D
30 0.50
1.00 0.50
- E
40 0.50
1.00 0.50
- F
50 0.50
1.00 0.50
- G
60 0.50
1.00 0.50
- H
70 0.50
1.00 0.50
- I
80 0.50
1.00 0.50
- J
90 0.50
1.00 0.50
- A
0.50 1.00
0.40 0.10
B 10
0.50 1.00
0.40 0.10
C 20
0.50 1.00
0.40 0.10
D 30
0.50 1.00
0.40 0.10
E 40
0.50 1.00
0.40 0.10
F 50
0.50 1.00
0.40 0.10
G 60
0.50 1.00
0.40 0.10
H 70
0.50 1.00
0.40 0.10
I 80
0.50 1.00
0.40 0.10
J 90
0.50 1.00
0.40 0.10
dengan penambahan kawao
54
Tabel 7. Pengaruh Lama Pemanasan
Tabung reaksi
ke- Lama
Pemanasan detik
Larutan sukrosa
50 gl ml
Larutan invertase
0.01 gl ml
Aquades ml
Larutan kawao
ml A
0.50 1.00
0.50 -
B 10
0.50 1.00
0.50 -
C 20
0.50 1.00
0.50 -
D 30
0.50 1.00
0.50 -
E 40
0.50 1.00
0.50 -
F 50
0.50 1.00
0.50 -
G 60
0.50 1.00
0.50 -
H 300
0.50 1.00
0.50 -
A 0.50
1.00 0.40
0.10 B
10 0.50
1.00 0.40
0.10 C
20 0.50
1.00 0.40
0.10 D
30 0.50
1.00 0.40
0.10 E
40 0.50
1.00 0.40
0.10 F
50 0.50
1.00 0.40
0.10 G
60 0.50
1.00 0.40
0.10 H
300 0.50
1.00 0.40
0.10
dengan penambahan kawao
55 Lampiran 3. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan
A. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan penentuan konsentrasi kawao
