20 program SigmaPlot 2004 for Windows Version 9.01 dari Systat
Software Inc.
2. Prosedur Percobaan
Prosedur percobaan yang dilakukan pada penelitian ini adalah sebagai berikut.
a. Penentuan aktivitas invertase
Larutan kerja invertase 0.01 gl yang telah dibuat seperti pada Lampiran 1, disiapkan pada 8 buah tabung reaksi dengan volume
masing-masing 1 ml. Secara terpisah, disiapkan pula larutan sukrosa 50 gl pada 8 buah tabung reaksi berbeda, dengan volume masing-
masing 0.5 ml sukrosa dan 0.5 ml air. Seluruh tabung reaksi tersebut yang berjumlah 16 buah, kemudian diinkubasi dalam penangas air
yang bersuhu 55°C selama kurang lebih 5 menit. Selanjutnya secara berpasangan, tiap tabung yang berisi sukrosa dimasukkan ke dalam
tabung reaksi yang berisi invertase, reaksi berlangsung pada kondisi suhu 55
o
C. Waktu reaksi t mulai diukur pada saat larutan sukrosa kontak dengan invertase. Reaksi dihentikan pada masing-masing
waktu yang diujikan, yaitu 30, 60, 90, 120, 180, 240, dan 300 detik, dengan menambahkan 2 ml pereaksi DNS. Setelah itu dimasukkan ke
dalam penangas air pada suhu 95 °C selama 10 menit. Setelah 10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.
b. Penentuan konsentrasi inhibitor
Persiapan ekstrak kawao dilakukan dengan cara mencampurkan satu bagian akar kawao dengan dua bagian air
berdasarkan bobot, selanjutnya akar kawao ditumbuk dan cairan ekstrak dipisahkan hingga diperoleh ekstrak kawao. Ekstrak kawao
yang diperoleh disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit, lalu dibuat dalam beberapa konsentrasi, 0 – 25 vv ke dalam tabung
reaksi. Setiap tabung selanjutnya ditambahkan larutan sukrosa 50 gl sebanyak 0.5 ml dan divortex. Kemudian ditambahkan 1 ml invertase
21 0.01 gl pada masing-masing tabung reaksi waktu reaksi mulai
dihitung, t = 0. Pada saat waktu reaksi 5 menit t = 5 menit, reaksi dihentikan dengan penambahan pereaksi DNS. Prosedur penghentian
reaksi dan pengukuran sesuai dengan prosedur sebelumnya pada penentuan aktivitas invertase.
c. Penentuan pengaruh perubahan faktor
Penentuan pengaruh perubahan faktor dilakukan pada kondisi dengan penambahan inhibitor kawao yang dibandingkan dengan
perlakuan kondisi normal tanpa penambahan inhibitor kawao. Prosedur yang dilakukan pada perlakuan tanpa inhibitor normal
sama halnya dengan pengujian pada penambahan inhibitor, hanya saja tidak ditambahkan larutan kawao. Untuk setiap pengujian pengaruh
perubahan faktor, digunakan ekstrak kawao yang segar dan bukan berasal dari larutan stok ekstrak kawao. Total volume larutan dalam
setiap tabung reaksi pada pengujian tetap sama yakni 2 ml, sehingga volume yang ditambah atau dikurangi adalah aquades dan buffer.
Secara tabulasi data perbandingan volume masing-masing komponen dapat dilihat pada Lampiran 2.
1. Pengaruh konsentrasi enzim Larutan kerja enzim invertase 0.01 gl disiapkan pada
rentang volume 0.0 - 0.83 ml yang kemudian volume larutan digenapkan dengan penambahan larutan buffer pH 7 hingga
volumenya 1 ml. Kemudian ditambahkan larutan kawao sebanyak 0.1 ml pada masing-masing tabung reaksi. Selanjutnya larutan
sukrosa 50 gl sebanyak 1 ml dimasukkan pada tiap-tiap tabung tersebut, dan mulai dihitung waktu reaksinya t = 0 menit. Reaksi
berlangsung pada suhu ruang 28 ± 2
o
C, saat waktu reaksi 5 menit dimasukkan 2 ml pereaksi DNS untuk menghentikan reaksi.
Kemudian tabung tersebut dimasukkan ke dalam penangas air pada suhu 95°C selama 10 menit. Setelah 10 menit, tabung reaksi
dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.
22 2. Pengaruh konsentrasi substrat
Larutan invertase 0.01 gl sebanyak 1.0 ml dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi yang sebelumnya telah
ditambahkan larutan sukrosa 50 gl pada rentang konsentrasi yang berbeda dan larutan kawao sebanyak 0.1 ml. Kemudian aquades
ditambahkan hingga volume campuran mencapai 2.0 ml. Waktu reaksi dihitung saat enzim mulai ditambahkan ke dalam larutan
sukrosa, reaksi berlangsung pada suhu ruang 28 ± 2
o
C selama 5 menit. Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur
sebelumnya. 3. Pengaruh pH
Larutan invertase 0.01 gl sebanyak 1.0 ml dilarutkan dengan menggunakan buffer pH yang bervariasi pH 3 - 11 pada
tabung reaksi. Selanjutnya masing-masing tabung reaksi ditambahkan larutan kawao sebanyak 0.1 ml dan 0.9 ml larutan
sukrosa 50 gl. Waktu reaksi dihitung saat sukrosa mulai ditambahkan ke dalam larutan enzim, reaksi berlangsung selama 5
menit pada suhu ruang 28 ± 2
o
C. Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya.
4. Pengaruh suhu Disiapkan penangas air mulai suhu 0 - 90
o
C, dengan interval suhu 10
o
C. Pada setiap kelipatan suhu 10
o
C tersebut, diuji aktivitas invertase. Larutan kawao sebanyak 0.1 ml, 0.4 ml air dan
larutan sukrosa 50 gl sebanyak 0.5 ml dimasukkan ke dalam tabung untuk setiap kelipatan suhu 10
o
C. Tabung reaksi selanjutnya dimasukkan ke dalam penangas air pada rentang suhu
tersebut dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian ditambahkan invertase 0.01 gl sebanyak 1.0 ml ke dalam masing-masing
tabung reaksi. Waktu reaksi dihitung saat enzim mulai ditambahkan ke dalam larutan sukrosa, reaksi berlangsung selama
5 menit pada masing-masing suhu pengujian. Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya.
23 5. Pengaruh lama pemanasan
Larutan invertase 0.01 gl sebanyak 1.0 ml dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi yang telah berisi air 0.4 ml,
kemudian dipanaskan dengan waktu yang bervariasi yaitu 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 dan 300 detik. Setelah waktu yang diperlukan
tercapai, tabung reaksi dikeluarkan dari penangas air dan didinginkan. Setelah itu ditambahkan ke dalamnya larutan kawao
sebanyak 0.1 ml dan terakhir ditambahkan larutan sukrosa 50 gl sebanyak 0.5 ml. Waktu reaksi dihitung saat sukrosa mulai
ditambahkan ke dalam larutan enzim, reaksi berlangsung selama 5 menit pada suhu ruang 28 ± 2
o
C. Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya.
d. Penentuan parameter kinetika
