37 berakibat pada terjadinya illegitimasi benih yang dihasilkan.Illegitimasi
merupakan faktor tersembunyi yang memiliki dampak buruk bagi keberhasilan program pemulian tanaman. Illegitimasi pada tanaman kelapa sawit dapat
mungkin terjadi pada setiap fase persilangan terkontrol mulai dari isolasi bunga, pelabelan, pemanenan hingga proses penanaman dilapanganHama-Ali et al.,
2015. Banyak faktor penyebab terjadinya illegitimasi benih baik secara biologis tanaman, kesalahan manusia, hingga kerusakan penutup sungkup bunga baik
disebabkan oleh hewan maupun lingkungan. Akibat terjadinya illegitimasi benih atau kontaminasi benih, bagi program pemuliaan tanaman yaitu akan
menyebabkan ketidaktepatan didalam menentukan tetua terbaik bahkan dapat menyebabkan dianulirnya hasil persilangan akibat kontaminasi yang terjadi.
Sedangkan untuk produksi benih komersial, tanaman hasil persilangan yang mengalami kontaminasi, akan menyebabkan terjadinya penurunan produksi yang
cukup signifikan. Hal tersebut diakibatkan adanya tipe dura didalam pertanaman, yang memiliki karakter produksi rendah karena ketebalan cangkangnya yang
tinggi.
Identifikasi illegitimasi maupun analisis keragaman genetik secara konvensional membutuhkan waktu yang cukup lama. Identifikasi baru dapat
dilakukan pada umur tanaman 3 tahun setelah tanam yaitu pada saat tanaman sudah mengalami fase generatif. Marka molekuler dapat menjadi solusi untuk
mempercepat analisis ilegitimasi pada tanaman kelapa sawit selain juga dapat digunakan untuk analisis keragaman genetik dan pemetaan QTL Quantitative
Trait LocusHama-Ali et al., 2015. Penggunaaan marka molekular dalam melakukan analisis genetik pada tanaman tahunan seperti coklat, kelapa dan
kelapa sawit telah banyak dilakukan. Moose Mumm, 2008; Tornincasa et al., 2010; Zulhermana et al., 2010; Ajambang et al., 2012; Solin et al., 2014; Ajijah et
al., 2015; Maskromo et al., 2015.
Salah satu metoda marka molekuler yang sangat efektif didalam melakukan analisis genetik adalah marka SSR Simple Sequence Repeat. Billotte et al
2001 telah sukses menggunakan marka SSR di dalam melakukan karakterisasi plasma nutfah dan melakukan penelitian genomik tanaman kelapa sawit. Hal
tersebut disebabkan karena marka SSR memiliki tingkat keragaman alel yang tinggi, selain juga marka SSR sangat efektif didalam melakukan studi genetik
pada tanaman kelapa sawit, identifikasi plasma nutfah dan pemetaan genetik intra maupun interspesifik. Beberapa alasan mengapa marka SSR cocok untuk studi
genetik adalah 1 jumlahnya yang tidak terbatas, dan tersebar merata didalam genome, 2 Memiliki tingkat polimorfisme yang tinggi dan bersifat co-dominant,
3 Metoda yang digunakan relatif mudah dan cepat didalam perbanyakannya menggunakan teknik PCR dan juga relatif mudah dan cepat didalam
mengintepretasikan konfigurasi alel, dan 4. Metoda ini relatif mudah diakses oleh laboratorium lainSaghai-Maroof et al., 1994. Marka SSR adalah marka co-
dominant. Marka ini dapat membedakan antara tanaman yang memiliki genotipe heterozigot dengan individu tanaman yang bergenotipe homozigot Akkaya et al.,
1992; Jones et al., 2010.
Penelitian ini bertujuan untuk melihat sejauh mana keragaman genetik yang dimiliki antar tetua dan keturunannya, serta melihat tingkat kemurnian dari
persilangan yang dihasilkan berdasarkan kebenaran persilangan antar tetua.
38
4.2 Bahan dan Metode
Penelitian dilakukan pada bulan April 2014 sampai April 2015 di Laboratorium Bioteknologi, PT.Astra Agro Lestari Tbk., Pangkalan Bun,
Kalimantan Tengah. Sampel daun dikoleksi dari area pembibitan dan lahan percobaan PT. Astra Agro Lestari di Pangkalan Bun, Kalimantan Tengah. Total
147 individu dari 4 populasi telah dievaluasi.Populasi terdiri dari dua populasi D x D , satu populasi T x T, dan satu populasi persilangan D x T. Table 1. 4A.
Jumlah individu per populasi yang dievaluasi berkisar 20 hingga 75 individu per populasi. Jaringan tanaman diambil dari daun tombak pada tanaman dibibitan dan
dilapangan.
Tabel 11. Daftar populasi kelapa sawit yang dievaluasi dalam penelitian
Family Genetic backgroun
No. of individuals
Type Female
M ale
B57 LM 5TxLM 10T X RS3T AF
LM 5TxLM 10T X RS3T AF 29
TxT A140
DA115D x DA3D DA115D x DA3D
23 D self
A125 DA10D x DA115D
DA10D x DA115D 20
D self C22
DA115D LM 5TxLM 10T X RS3T AF
75 DxT
Tot al 147
4.2.1 Bahan Kimia
Bahan kimia yang digunakan yaitu Genomic DNA Mini Kit Geneaid, ddH
2
0, Agarose, buffer GPX1, buffer GP3, buffer W1, buffer Wash, TAE 1x, loading dye, Bromfenol biru, elution buffer, KAPA 2G Fast Ready Mix,
nucleasefree water, primer forward, primer reverse, label Fluorescent FAM, HEX,ROX, TAMRA.
4.2.2 Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan alat Tissue lyser menggunakan prosedur dari Geneaid kit. Sampel daun kelapa sawit kering
sebanyak 100 mg ditambah dengan 400 µl buffer GPX1. Selanjutnya dimasukkan ke dalam collection tube . Sampel yang telah berada di collection tube setelah
diberi bead bola besi dimasukkan ke dalam tissue lyser dan dikocok didalam tissue lyser dengan frekuesi 30 Hz selama 5 menit.
Selanjutnya dilakukan inkubasi tabung berisi sampel ke dalam waterbath suhu 60
C selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 100 µl buffer GP2 dan dicampur dengan di vortex. Tabung didinginkan di dalam kulkas -20
C selama 3 menit. Selanjutnya seluruh campuran sampel dipindahkan ke dalam tabung filter
colum dan disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 1000 g. Supernatan dipindahkan ke mikrotube 1.5 ml tanpa menyentuh pelet yang terbentuk.
Kemudian ditambahkan 1.5 kali buffer GP3 600 µl. Mencampurkan larutan dengan dibolak balik dan divortex.
39 Selanjutnya 600 µl campuran dipindahkan ke dalam kolom GD. Campuran
kemudian disentifugasi pada kecepatan 14.000 g selama 2 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang. Kemudian ditambahkan buffer W1 sebanyak 400 µl.
Campuran disentrifugasi pada kecepatan 14.000 g selama 1 menit. supernatan yang terbentuk dibuang kembali. Selanjutnya ditambahkan buffer Wash sebanyak
600 µl. Campuran disentrifugasi kembali, dan supernatan yang terbentukdibuang kembali. Selanjutnya dilakukan sentifugasi pada kecepatan 14.000 g selama 3
menit.
Kolom GD dipindahkan ke mikrotube 1.5 ml yang baru. Selanjutnya ditambahkan 50 µl elution buffer yang telah dipanaskan pada 60
C tepat ditengah kolom. Kemudian didiamkan kolom selama 5 menit. Dan dilakukan sentrifugasi
kembali 14.000 g selama 1 menit. Sample disimpan pada suhu -20 C.
4.2.3 Primer yang Digunakan
Primer yang digunakan dalam penelitian ini merupakan primer yang bersumber dari TropGene Cirad
Tabel 2.
4.2.4 Analisis Kuantifikasi dan Kualitifikasi DNA
Analisis kuantifikasi dan kualifikasi dilakukan dengan menggunakan alat Nano Drop 2000 spectrophotometer yaitu dengan mengukur absorbansi DNA
pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Penentuan kualitas DNA dapat dilakukan dengan menghitung rasio absorbansi pada A260 dengan A280. Nilai
rasio yang mendekati 2 menunjukkan tingkat kemurnian yang tinggi. Namun semakin rendah nilai rasio tersebut maka semakin rendah kualitas DNA akibat
adanya kontaminasi protein.
Penentuan kualitas juga dilakukan menggunakan metode elektroforesis. Pita DNA genom yang memiliki kualitas yang baik akan tampak sebagai pendar
tak putus pada gel agaros setelah proses elektroforesis. Gel yang digunakan adalah gel agarosa dengan konsentrasi 1 1 gram agarosa dalam 100 mL TAE 1x
0.04M Tris Asetat; 0.001M EDTA.
Genom DNA hasil isolasi sebanyak 5 µL dicampur dengan 1 µL loading dye [0.25 wv Bromfenol biru, 30 wv sukrosa dalam air]. Campuran
tersebut dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel elektroforesis yang direndam TAE 1X dalam chamber elektroforesis Mupid ®-exU, Advance. Proses
elektroforesis dilakukan selama 30 menit dengan tegangan 100 Volt.
Gel hasil elektroforesis dimasukkan kedalam etidium bromide selama 5 sampai 10 menit kemudian dibilas dengan akuades. Hasil pewarnaan kemudian
diamati menggunakan
UV Transilluminator
Major Science
dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera.
4.2.5 Amplifikasi PCR
Pencampuran PCR master Mix dan primer dilakukan menggunakan mesin Qiagility yang bekerja secara robotik mencampur komponen PCR seperti Buffer,
dNTP, MgCl2, dan DNA polymerase. Dalam percobaan ini 7.5 µl KAPA 2G Fast Ready Mix 2x, 2.2 µl nuclease free water, 0.15µl primer forward 10 µM, IDT,
0.15 µl primer reverse yang diberi label fluorescent yang digunakan dalam penelitian ialah 6-carboxy-fluo-rescine FAM, hexachloro-6-carboxy-fluo-
rescine HEX, 6-carboxy-X-rhodamine ROX, dan tetrachloro-6-carboxy-
